间充质干细胞的免疫调节作用

由于MSC具有一定的分化潜能，最初的研究主要集中在利用MSC的分化再生能力治疗一些与组织修复相关的疾病。但近年来的研究发现MSC在体内更多效应是通过其强大的旁分泌机制来实现的，MSC在促进血管形成、防止细胞凋亡、抑制炎症反应、调控细胞外基质等过程中发挥重要作用。研究显示，不管是自体还是异体MSC，都具备免疫调节的功能。MSC可以通过细胞间接触或分泌可溶性因子实现对先天免疫和适应性免疫的调控作用。依据不同的免疫环境，当免疫系统活性低时，MSC可以促进炎症反应，而当免疫系统过度激活时，MSC又可以抑制炎症反应，防止过度免疫反应引起的组织损伤。

（一）间充质干细胞的免疫调控机制

目前关于MSC参与免疫系统调控的机制研究还不是很透彻，现有的观点认为MSC通过细胞间接触和分泌多种可溶性因子这两类机制发挥免疫调控作用。参与MSC免疫调控的主要信号分子包括：

1.TGF-β1和HGF

TGF超家族调控多种生理和细胞功能，包括细胞生长、分化、胚胎发育、肿瘤形成等过程。MSC持续表达TGF-β1和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)，两者都能抑制同种异体抗原(alloantigen)激活的T细胞增殖。目前研究表明TGF-β1参与MSC调节的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的形成以及抑制免疫细胞的增殖并诱导细胞凋亡。HGF是一种多功能的细胞因子，参与细胞生长、形态发生、细胞迁移、血管形成等过程的调控。HGF也能促进Treg细胞的形成、干扰DC细胞的功能，参与免疫调控。

2.吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)

IDO催化色氨酸降解生成犬鸟氨酸。色氨酸是T细胞增殖所必需的氨基酸。IDO一方面代谢色氨酸造成色氨酸耗竭抑制T细胞增殖，另一方面代谢产物犬尿氨酸的累积也抑制T细胞的增殖。另外，IDO还参与调控Treg细胞的形成、抑制DC细胞的成熟和功能、抑制Th17细胞的分化以及IL-2激活的NK细胞的增殖和细胞毒活性。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞也利用IDO抑制免疫，逃避免疫监控。

3.前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)

MSC持续表达环加氧酶COX1和COX2，与PGE合成酶一起参与催化花生四烯酸生成前列腺素。T细胞和巨噬细胞是最易受PGE2影响的免疫细胞。PGE2抑制T细胞增殖，促进细胞分泌IL4和IL-10，促进CD4+CD25+Foxp3+及IL-10+IFNγ+CD4+调节性T细胞的分化。另外，PGE2还下调巨噬细胞中MHC-Ⅱ类分子的表达，抑制单核细胞分化为DC细胞，抑制IL-2激活的NK细胞增殖。利用化学阻断剂indomethacin或NS-398抑制COX的作用，可以减弱MSC的免疫抑制作用。

4.白介素10(IL-10)

IL-10存在于MSC与免疫细胞共培养上清液中，有文献报道人和小鼠MSC均表达IL-10,Toll样受体3(TLR3)信号增加入MSC的IL-10表达水平。也有报道认为IL-10是由免疫细胞生成的，MSC与T细胞之间的接触对IL-10的形成至关重要。IL-10抑制各种免疫细胞中IL-2、TNF-α、IL-12、IFN-γ的表达，同时下调细胞表面MHC-Ⅰ类分子的表达，起到抗炎作用。MSC与CD4+CD25+Treg细胞共培养后，IL-10促进Treg细胞表达PD-1，进一步提升Treg细胞的免疫抑制功能。另外，IL-10抑制DC细胞的成熟和功能，并且通过下调CD107a抑制NK细胞的细胞因子释放和细胞杀伤功能。

5.HLA-G5

HLA-G是一类非经典的HLA分子，骨髓来源的MSC表达膜结合型的HLA-G1以及可溶型的HLA-G5。IL-10促进HLA-G5的表达，反过来，HLA-G5通过正反馈调控又促进IL-10的表达。IL-10与HLA-G5之间这种正反馈调控作用需要MSC与T细胞的直接接触，最终形成免疫抑制的微环境，促进Treg细胞的形成。

6.半乳糖凝集素(galectins)

半乳糖凝集素是凝集素超家族中的一个，对β半乳糖苷有特殊亲和力。半乳糖凝集素参与固有免疫和适应性免疫的调控。MSC持续表达并释放半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素3和半乳糖凝集素9，利用siRNA抑制半乳糖凝集素表达或者用中和抗体可以减弱MSC对T细胞和B细胞的抑制作用。

除了以上这些可溶性因子，MSC还通过细胞间接触调节不同免疫细胞的生长、存活和功能。介导这些效应的两个主要分子是PDL1和FASL。PDL1与免疫细胞表达的PD1或CD80结合后抑制活化T细胞的功能。降低MSC中PDL1的表达水平可以减弱MSC的免疫抑制功能。MSC还通过FASL激活T细胞的FAS信号通路，从而诱导T细胞凋亡。凋亡的T细胞进一步促进巨噬细胞分泌TGFβ，进而促进Treg细胞的形成，抑制免疫。

总体来说，MSC的免疫调控机制非常复杂，目前认识仍不是非常清楚。已知MSC通过这些信号分子的联合作用发挥免疫调控功能，在不同的免疫环境下发挥不同效应，拮抗任一分子都不能完全阻断MSC的作用。

（二）间充质干细胞对免疫细胞的调控

1.单核细胞和巨噬细胞

单核细胞在迁移到组织或者受到炎性刺激后分化形成巨噬细胞，巨噬细胞在炎症反应和组织再生过程中起着关键作用。在监测到细菌病原体时，小鼠骨髓MSC通过释放CCL2，促进单核细胞从骨髓入血。而且，人和小鼠骨髓MSC可以通过CCL3、CXCL2和CCL12招募单核细胞和巨噬细胞到炎症部位。在炎症微环境中，巨噬细胞可以被极化为活性形式的M1型或M2型巨噬细胞，M1型巨噬细胞具有很强的抗菌活性，而M2型巨噬细胞通过释放IL-10促进炎症消退和组织修复，分泌营养因子并促进凋亡细胞的清除。骨髓MSC与单核细胞共培养后，通过IDO和PGE2依赖的调控机制促进M2巨噬细胞的产生，提升IL-10的产生并降低TNF和IFN-γ以及MHC-Ⅱ类分子的表达。促炎症因子如IFN-γ、TNF、LPS或者异体激活的T细胞可以增加骨髓MSC中COX2以及IDO的表达，从而进一步促进M2型巨噬细胞的极化。M2型巨噬细胞分泌的IL-10可以抑制中性粒细胞在受伤组织的过度浸润，一方面避免组织的过度损伤，另一方面可以让更多的中性粒细胞保留在血液中从而清除血液循环中的病原微生物。

另外，MSC还通过分泌TSG6(TNF-stimulated gene 6)干扰巨噬细胞中的TLR2-NF-κB信号通路，从而降低巨噬细胞的活性。而且人和小鼠MSC还可以分泌IL-1受体拮抗剂防止巨噬细胞释放TNF。单核细胞还释放IL-1β，IL-1β可以增强MSC分泌TGF-β，从而抑制T淋巴细胞的作用。

总体来说，MSC通过招募单核细胞和巨噬细胞并诱导形成M2型巨噬细胞后，促进伤口的愈合，并通过负反馈调控机制防止过度的炎症反应，促进组织再生。

2.中性粒细胞

中性粒细胞是固有免疫系统中数量最多的一类细胞，是重要的抗菌细胞。中性粒细胞主要存在于血液中，但当机体受到损伤时会很快聚集到受伤部位，发挥吞噬作用并释放杀菌分子。天然MSC或者TLR3刺激的骨髓MSC通过IL-6、IFN-β或GM-CSF依赖的信号通路促进静息期或者IL-8激活的中性粒细胞的存活。MSC和中性粒细胞共培养可以上调中性粒细胞中抗凋亡分子MCL1的表达，而下调促凋亡分子BAX的表达，并增强中性粒细胞的代谢能力。通过这些机制，MSC可以保持骨髓中中性粒细胞的数量，使得机体在受到病原体入侵时可以让中性粒细胞快速释放进入血液循环。

3.肥大细胞

肥大细胞(mast cell)是参与过敏反应的主要固有免疫细胞，同时在宿主防御和自身免疫中起重要作用。通过PGE2介导的途径，骨髓MSC可以抑制肥大细胞的多种功能，包括细胞迁移、TNF的产生以及脱颗粒作用。

4.自然杀伤细胞

自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)是参与固有免疫的主要效应细胞，在清除病毒感染或应激细胞方面发挥关键作用。同时NK细胞可以产生炎性细胞因子，如IFN-γ和TNF。体外共培养实验显示，对于新鲜分离的NK细胞，人骨髓MSC可以抑制IL-2和IL-15刺激的NK细胞增殖，但对其细胞毒性作用没有影响。但在共培养条件下，对于经IL-2或IL-15激活后的NK细胞，MSC可以抑制NK细胞的细胞毒性作用、细胞因子的产生、颗粒酶B的释放以及NKp30、NKp44、NKG2D等活化受体的表达。MSC主要通过细胞间接触以及PGE2、IDO、TGFβ介导的途径实现对NK细胞的调控。

另外，NK细胞同时表达活化和抑制性受体，活化或抑制性信号的水平决定了NK细胞的效应功能，当活化信号强于抑制性信号时，NK细胞被激活。人骨髓MSC也表达一些活化配体可以激活NK细胞，如ULBP3、PVR和nectin2，经IL-2、IL-12、IL-15以及IL-18等激活的自体或异体NK细胞可以杀伤MSC细胞。然后，在高水平的IFN-γ环境可以刺激MSC表达抑制性配体HLA-G5，同时下调ULBP3的表达。MSC的这种变化加上COX2以及IDO等的协同作用使得MSC对NK细胞的抑制作用增强，从而抑制NK细胞的细胞毒效应。总体来说，MSC与NK细胞的相互作用受到细胞活化状态的影响，同时细胞所处微环境中IFN-γ的水平也决定了两种细胞之间相互作用的最终结果。

5.T淋巴细胞

MSC利用多种途径调控T淋巴细胞的功能。首先，MSC抑制机体固有免疫的激活，维持巨噬细胞、单核细胞以及DC细胞处于未成熟的抗炎状态，防止效应T细胞的激活，同时促进Treg细胞的形成。其次，MSC通过产生多种免疫抑制分子，如IDO、PGE2、TGFβ、HGF、PDL1及半乳糖凝集素直接调控T细胞的功能。MSC对T细胞的直接调控效应包括抑制CD8+细胞毒T细胞的激活以及Th1和Th17的分化，促进CD3+CD25+Foxp3+Treg细胞的形成。当Treg细胞形成后，MSC进一步维持Treg细胞的状态，促进Treg细胞稳定从而更长时间的保持免疫抑制功能。

6.树突状细胞

树突状细胞(dendritic cell,DC)是体内最主要的抗原提呈细胞，其最主要的功能是加工处理抗原后向T细胞提呈抗原。体内，DC细胞来源于CD34+细胞；体外，IL-4和GM-CSF刺激单核细胞分化形成DC细胞。体内大部分DC细胞处于未成熟状态，未成熟的DC细胞与诱导免疫耐受有关。当DC细胞在摄取抗原或受到某些因素刺激时即分化为成熟的DC，在这过程中，细胞MHC-Ⅱ类分子、T细胞共刺激分子CD80、CD86的表达水平上升。MSC影响DC细胞的招募、成熟和功能发挥，抑制单核细胞分化形成DC细胞，抑制CD1a、CD40、CD80、CD86以及HLA-DR表达水平的上升。另外，MSC抑制DC细胞分泌TNFα，进而抑制DC细胞的成熟以及向淋巴结的迁移和对T细胞的刺激功能。MSC还抑制DC细胞分泌IL-12，低水平的IL-12与T细胞的免疫耐受有关。还有文献报道人骨髓MSC通过Notch信号通路诱导CD34+造血前体细胞分化形成调节性DC细胞，调节性DC细胞表达高水平的IL-10和低水平的IL-2，并且抑制同种异体反应T细胞的增殖和功能，诱导Treg细胞的形成。MSC通过不同的机制在多个阶段影响DC细胞功能，最终抑制免疫细胞应答。

（三）免疫微环境对MSC免疫调节功能的影响

研究表明MSC的免疫调控作用并不是内在的，它受到多种因素的影响，其中免疫微环境中免疫细胞来源的炎性细胞因子对MSC的作用有着重要影响。这其中IFN-γ信号是调节MSC免疫功能最关键的细胞因子。IFN-γ由T细胞和NK细胞合成，当与MSC细胞表面的受体结合后促进MSC表达TGF-β、HGF、IDO、PGE2、PDL1等免疫调节分子。

炎症早期，低浓度的IFN-γ不能诱导MSC的免疫抑制能力，MSC表现出免疫促进作用，协助机体建立适当的免疫反应。小鼠模型显示，存在于组织中的MSC识别微生物分子后分泌多种细胞因子（如：IL-6、IL-8、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)），从而招募中性粒细胞，增强炎症反应，同时也促进中性粒细胞的存活，中性粒细胞迁移至炎症部位后发挥细胞吞噬作用。除了中性粒细胞，MSC在受到炎性细胞因子刺激后可以分泌趋化因子CXCL-9、CXCL-10、CXCL-11，从而招募淋巴细胞促进炎症反应。当炎症反应达到一定强度后，受到免疫环境中高水平的炎症因子（如IFN-γ，TNF-α，IL-17等）刺激，MSC中COX2和IDO的表达水平升高，使得细胞分泌更多的免疫抑制因子（如PGE2，色氨酸代谢产物）抑制免疫细胞的作用，促进M2巨噬细胞的形成，从而抑制免疫反应。

炎症环境中除了促进炎症的细胞因子，还含有免疫抑制性的细胞因子，如TGF-β，起着维持免疫平衡的作用，同时也影响MSC的免疫调控功能。MSC表达TGF-β受体Ⅰ和Ⅱ，调控MSC的再生和分化。用IFN-γ或TNF预处理MSC可以促进MSC的免疫抑制作用，但同时添加TGF-β1或TGF-β2，则可以下调由IFN-γ激发MSC的免疫抑制作用。有趣的是，由于MSC自身表达大量的TGF-β，当TGF-β在MSC微环境中积累后反过来又可以通过Smad3下调MSC细胞中IDO的表达，降低MSC的免疫抑制作用，从而对MSC的免疫抑制作用形成反馈调控。

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是参与天然免疫的一类重要蛋白质分子，可以识别来源于微生物的病原分子并激活机体产生免疫应答。Toll样受体信号不仅激活免疫细胞应答，同样对MSC具有调控作用。体外培养的MSC动态表达多种Toll样受体，当受到不同的TLR信号刺激后MSC可以产生不同的免疫调节效应。在缺氧条件下，MSC受到促炎症因子IFN-γ、TNF、IFN-α、IL-1β刺激后上调部分TLR表达，增加MSC对炎症的敏感性。而持续激活TLR又反馈抑制TLR2和TLR4的表达，以防止免疫细胞过度活化，维持免疫稳态。细胞表面不同的TLR可以识别不同的病原分子，例如TLR4识别细菌LPS,TLR3识别病毒双链RNA。MSC在受到不同的TLR刺激信号后可以极化为两种不同的表型，产生不同的免疫调节效应，如TLR4激发的MSC表现出促炎症表型，TLR3激发的MSC表现出抗炎表型。

由于MSC的免疫调节作用受到炎症微环境中多种因素的影响，在MSC临床应用时患者前期的治疗方案对MSC的疗效也有重要的影响。例如，在一些免疫系统相关的疾病治疗过程中常用到免疫抑制剂，如环孢素(cyclosporin)以及地塞米松(dexamethasone)。研究显示，环孢素和地塞米松都可以抑制MSC的免疫抑制作用。类似于TGF-β对MSC的反馈调控作用，免疫抑制剂主要通过抑制MSC中IDO的表达从而降低MSC的免疫抑制作用。MSC的这一作用特点对临床应用具有一定的指导意义。临床研究的结果显示，在免疫抑制剂耐受的患者中采用MSC治疗时往往效果更好。在免疫抑制剂耐受的患者体内，持续的炎症反应可能为诱发MSC的免疫抑制作用提供合适的微环境。另一方面，对免疫抑制剂有效的患者，联合MSC和免疫抑制剂进行治疗没有明显的疗效提升。考虑到炎症因子对MSC的调控作用，在利用MSC治疗一些炎症相关疾病时，可以先对MSC利用IFN-γ等细胞因子进行预处理，诱导增强MSC的免疫抑制作用，从而提高MSC治疗的效果。在结肠炎、GVHD等动物模型的研究中证实预处理后的MSC治疗效果得到明显的提升，这为进一步提升MSC在临床上的疗效提供了实验基础。