自体胰岛细胞移植（IAT）

（一）简史及现状

1894年，英国医生 Williams和 Harsant采用部分绵羊胰腺成分移植到皮下的方法治疗1例发生了酮症酸中毒的15岁1型糖尿病少年。虽然移植物发生排异而很快失效，但这次尝试开创了胰岛移植的历史。1976年胰岛移植应用于临床，20世纪80年代，胰岛分离和纯化技术出现飞跃发展。

世界上首例胰腺切除术后自体胰岛移植在1977年由美国明尼苏达大学完成，患者是一位39岁的女性遗传性胰腺炎患者。术后她的疼痛完全缓解且术后连续六年无须使用胰岛素，直至因与胰腺无关的疾病去世。后期在对10例慢性胰腺炎患者的IP-IAT治疗中，有3例获得了不同程度的不依赖胰岛素状态。随后，患者同种异体胰岛细胞移植逐渐开始进行临床研究，但成功率非常低，主要原因是分离的胰岛数量不足。

1988年，Ricordi等发明了半自动胰岛分离系统，解决了胰岛分离和纯化的技术障碍。1992年，Pyzdrowski等报道了移植26.5万个胰岛细胞团足以使1型糖尿病患者摆脱对胰岛素的依赖。1995年，Minnesota大学报道了39例患者进行了为期4年的随访研究，51%的患者术后短期内达到胰岛素非依赖。移植术后2～10年间，34%的患者仍然不需要应用外源性胰岛素。两年内没有移植细胞失去功能的病例。至2000年以前，国际胰岛移植登记处（International Islet Transplant Registry，IITR）共登记了 447例同种异体成人胰岛移植，移植后只有不到10%的患者达到了超过1年的不依赖胰岛素状态，远远低于胰腺移植患者（70%以上）。

2007年，Minnesota大学再次总结该中心1977—2006年完成的胰腺切除术后自体胰岛移植情况，至2006年12月，该中心共完成198例手术。患者术后1年胰岛素不依赖率达到55%，33%患者术后10年仍然可以达到胰岛素不依赖，33%患者移植胰岛有部分功能，外源性胰岛素用量很小。

Cincinnati大学于2006年报道了其54例自体胰岛移植情况，平均随访18个月，66%患者术后移植胰岛有功能，术后胰岛素不依赖率达到40%。2008年，英国Leicester大学总结了46例胰腺切除术后自体移植病例，与同期单纯胰腺切除组相比，术后24小时胰岛移植组的胰岛素需求量明显减少。

根据华盛顿大学的R.Paul Robertson博士负责的研究小组观点，切除胰腺后的患者应将自体胰岛移植入肝脏以预防糖尿病，但由于该方法极少开展，因此权威书上也未有记载。Robertson博士研究小组曾对6例自体胰岛移植的非糖尿病患者进行随访（最长达13年，平均为6.2年），这些患者都切除了至少99%的胰腺。每位患者移植290 000～678 000个胰腺细胞。研究发现，仅1例发展为糖尿病，出现轻度空腹高血糖，但该患者移植的胰腺细胞最少。其余患者都未用胰岛素或其他降糖治疗。两位患者的HbA-1C升高，但经过降糖治疗后，也下降到正常范围。

2011年，Medical University of South Carolina报道了其39例自体胰岛移情况，在随访的12个月内，术后患者的疼痛完全减轻，不再需要麻醉镇痛，胰岛素不依赖率达24%，显著提高了患者生活质量。该中心自2009年成立以来，已经成功完成了86例胰腺全切除和自体细胞移植，其移植数量直追Minnesota大学。最新的数据表明40%～50%的患者在术后一年之内仍不需要胰岛素治疗。

至今，全球每年平均完成胰岛自体移植手术近千例，大部分集中在美国 Minnesota大学（约500例）、Cincinnati大学（约100例）、South Carolina医药大学（约86例）和英国Leicester大学（约46例），其成熟经验值得我们同道借鉴。

    表　全球主要自体胰岛移植中心数据

（二）自体胰岛分离及移植方法

胰岛移植手术首先切除胰腺的十二指肠部分，同时要保留幽门。胰腺切除后，将十二指肠与空肠吻合。手术中尽可能长时间的保证胰腺的血液供应，最大限度地减少胰腺的热缺血时间；最后分别结扎脾动脉和脾静脉。因此，通常热缺血时间不到1分钟。胰腺切除后，立即沉浸在预冷的改良的University of Wisconsin（UW）保存液中，尽量去除动脉，十二指肠和多余的脂肪及结缔组织。再从胰腺头部插入一条输液管至胰管中，以利于随后的胶原酶灌注，然后尽快送到胰岛分离室。运送过程即为胰腺的冷缺血时间，通常要小于1个小时。

图　自体胰岛移流程图

[引自Naftanel MA，Harlan DM.Pancreatic Islet Transplantation.PLoS Med，2004，1（3）：e58]

1.酶制剂的准备

酶制剂的准备与胰腺切除手术同步，在胰岛分离室中进行。胶原酶及其催化物分别存放在-20℃，在拿到胰腺组织前15分钟，用HBSS溶解，待完全溶解后，稀释到工作浓度，并加入Ca2+用于提高酶的活性，过滤后使用。

2.胰岛分离

胰岛分离应在无菌操作室中进行，无菌室的洁净度至少应达到10 000级。将预冷的稀释溶解后的胶原酶工作液经胰管灌入胰腺，多次注入确保消化充分。然后将胰腺切成2～3cm小块，注射器继续灌注胰腺。待灌注充分后，用Ricordi自动消化系统进行消化分离。消化过程中需随时检测消化液中胰岛状态及数量，以便及时终止消化，收集胰岛。由于自体胰岛移植不存在免疫学问题，且绿/红染色组织的百分比率。红染色的为细胞凋亡很多胰岛在消化过程中不能完全与外分泌组织分离，为避免损失这部分胰岛，如果粗提物不超过15ml，一般不主张进行纯化。如果粗提物体积过大，为防止移植术中发生门静脉栓塞，可以进行部分纯化。消化出来的胰岛经过洗涤后，最终将其重新悬浮在200～500ml人血清白蛋白液中，制成胰岛细胞悬液装袋后，运送到手术室用于移植。

3.胰岛细胞活力检测胰岛分离后，对胰岛的功能性进行初步评估。

我们使用两种荧光染料，SytoGreen 13和Ethidium Bromide。将两种荧光染料混合加入35mm培养皿中用PBS稀释后，加入100～200个胰岛室温，避光，孵育10～15分钟。使用适当的荧光过滤器，10倍物镜下观察，记录图像，并确定的胰岛细胞，绿染色的为活胰岛细胞。

图　自体胰岛移植手术及胰岛分离（南卡罗莱纳大学自体胰岛移植中心）

胰岛分离的过程一般需要3～4小时，因此，移植手术可以与胰腺切除手术在同一天完成。在胰岛制备期间里，外科手术应完成止血和胰岛细胞注射的准备工作。一般采取经门静脉或肠系膜静脉行胰岛细胞悬液输注。经门静脉或肠系膜静脉的属支向门静脉内置入导管并连接三通管至压力计来测量门静脉压。注射悬液5分钟前，给患者静脉注射肝素75～100U/kg体重，以预防胰岛组织周围形成凝血块。另外，静脉至少输入500ml胶体或血制品以确保中心静脉压（CVP）>10mmHg（1mmHg=0.133kPa）。胰岛细胞悬液于30～60分钟内缓慢注入门脉循环，手术过程中可能导致门静脉压力一过性升高，如果门静脉压力>40cmH2 O（1cmH2O=0.098kPa）或者患者血压降低，必须中断胰岛注入。一旦门静脉压力下降并且低血压通过静脉补液或注射血管加压素得以纠正，将在10～20分钟后继续进行胰岛注入。如门静脉压力持续升高，应停止细胞输注，可将剩余的胰岛移植到肾包膜下、胃小网膜囊、肠系膜等处。

（三）治疗效果

任何一种手术都有一定的危险因素。病变要发展，所以不治疗也有危险。有些手术成功率较低，危险性也较低，有些手术成功率高，但危险也大。所以对每个患者要全面了解病情并估计治疗方案的利弊。对某一个患者比较合适的治疗方法对另一个患者可能有害。慢性胰腺炎的治疗就是这样，因为每个人的情况，如年龄、病史，合并症等都不同。任何一种治疗方案要由患者和主治医生根据患者具体情况商定。

1.疼痛的治疗效果及生活质量的改善

慢性胰腺炎患者进行胰腺全切除或次全切除手术后，对于疼痛的治疗效果极好，而且可以避免疼痛的重复发作，有效地防止了频繁使用麻醉类药物和杜绝药物成瘾。术后，生活质量会明显改善，彻底消除炎症带来的难以忍受的疼痛，不再需要每天的药物维持。

图胰岛形态观察

A.光镜下胰岛形态；B.DTZ染色后胰岛形态；C.胰岛细胞活力检测（绿色：活细胞；红色：死细胞）

2.移植后糖尿病的预防

手术后不依赖胰岛素是IAT的最理想的治疗目标。但由于切除胰腺病变范围及程度、胰岛分离技术差异等因素，术后胰岛素不依赖率在各大中心并不一致，且随着胰腺切除手术适应证及手术时机变化、胰岛分离技术的进步，同一中心各时期获得的结果也不一样。随着胰岛细胞分离技术的改进，胰岛自体移植的效果逐渐得到改善。1980年，Minnesota大学报道了该中心实施的10例胰岛自体移植，仅有3例患者不需要应用外源性胰岛素。Traverso和Cameron等于1980年进行的两个小样本研究中取得了相似的结果，大约有25%～37%的患者不需要应用外源性胰岛素。1991年，Minnesota大学总结了24例慢性胰腺炎行胰腺全部或次全切除术后自体胰岛移植术情况，有5例术后完全脱离胰岛素（随访期为5个月至6年），其中1例患者死亡时自体移植物仍有功能。有3例患者术后早期不需要应用外源性胰岛素，移植术后18个月重新接受胰岛素治疗。2007年，Minnesota大学总结该中心完成的胰腺切除术后自体胰岛移植情况，患者术后1年胰岛素不依赖率达到55%，33%患者术后10年仍然可以达到胰岛素不依赖，33%患者移植胰岛有部分功能，外源性胰岛素用量很小。在Minnesota大学的病例中，胰岛素不依赖时间最长达到20年。Cincinnati大学2006年报道了其54例自体胰岛移植情况，平均随访18个月，66%患者术后移植胰岛有功能，术后胰岛素不依赖率达到40%。2008年，英国Leicester大学总结了46例胰腺切除术后自体移植病例，与同期单纯胰腺切除组相比，术后24h胰岛移植组的胰岛素需求量明显减少，但随着术后时间延长，患者平均空腹血糖水平升高，口服糖耐量实验（OGTT）评分下降，糖化血红蛋白（HbA1C）值升高。但C-肽水平均阳性，高糖刺激后明显增加。术后12例患者达到胰岛素依赖，平均脱离时间达到16.5个月。

英国Leicester大学的Steven White博士及其同事在24例患者中，观察了IAT的安全性和有效性。采用13例未进行IAT的相似患者作为对照。在胰腺切除术后，IAT组对胰岛素的需要量和糖化血红蛋白水平都显著低于对照组，最终有3例达到完全不需要外源性胰岛素。

我们中心（Medical University of South Carolina）自2009年开始进行临床人胰岛分离及移植手术，成功实施86余例，临床效果良好，一年后胰岛素不依赖率从20%～30%提高到现在的40%～50%左右。

3.糖的耐受性

胰岛素不依赖并不是评价自体胰岛移植是否成功的唯一指标。胰岛功能还可通过以下指标评估：静脉糖耐受中糖的清除率和HbA1C，也可通过胰岛素对血糖和精氨酸的反应评估胰岛素分泌储备能力。尽管随着术后时间延长，部分病例仅有部分胰岛发挥功能，胰岛的储备能力也有所下降，表现为高血糖刺激后胰岛素分泌量下降，但即使仅维持部分功能（C-肽阳性）也是十分重要的，有助于保持血糖水平稳定，使患者的糖尿病更易于“控制”，且可以减少低血糖的发生。同时，C-肽阳性可降低糖尿病慢性并发症如糖尿病肾病等的发生率。

4.消化功能的补偿

慢性胰腺炎患者进行胰腺全切或次全切术后胰液减少、胰酶分泌不足，使供给的能量物质消化不良，以致从粪便中丢失。而氨基酸、钙、镁和脂溶性维生素等也吸收不良，所以要给予胰酶制剂辅助治疗。有些患者脂肪吸收未能恢复正常，此时饮食中要控制脂肪摄入量。

（四）影响胰岛细胞移植成功的因素

获得足量的有功能胰岛是自体胰岛移植成功的关键与前提。胰腺自体移植手术后胰岛素不依赖率与移植胰岛数量显著相关。据国际胰岛移植机构（IITR）调查显示，从1990年1月1日至2000年12月31日，全球完成140例胰岛自体移植。1年内不需要外源性胰岛素治疗的占47%；如果注入>30万当量的胰岛细胞（islet equivalent number，IEQs），该数值可达71%。Minnesota大学资料也显示，当移植胰岛当量大于每公斤体重2000IEQ时，47%患者术后可以达到完全不依赖胰岛素，25%的患者可以到达间断脱离胰岛素。影响胰岛提取量的因素有很多，总体来说包括胰岛提取技术和胰腺本身因素两大类。

1.组织病理变化

慢性胰腺炎的病理变化以纤维化和腺泡萎缩为主要特征，部分患者出现残留导管细胞芽生所形成的类似于胚胎发生时的胰岛细胞样组织（nesidioblastosis），晚期病变到达胰腺内分泌组织，导致大部内分泌细胞减少，少数病例胰岛细胞显著增生，呈条索状和丛状。胰岛分离技术对46例成人以及18例儿童慢性胰腺炎胰腺切除术后自体胰岛移植患者的胰腺病理表现与胰岛提取量进行相关性分析，结果表明，胰腺纤维化和腺泡萎缩程度与胰岛提取量呈显著负相关，但炎症的程度和类型与胰岛提取量并不相关。纤维化评分1分的（<5%）患者术后胰岛素不依赖率达到100%，2分的患者（5%～20%）不依赖率降到40%，3分的患者（20%～50%）术后不依赖率为33%，4分的患者（>50%）术后不依赖率仅为11%。胰岛细胞增生的范围与程度与纤维化和萎缩的程度呈负相关，其严重程度和范围与胰岛提取量呈正相关。

2.手术史对胰岛自体移植的影响

Minnesota大学总结了1977—2004年自体胰岛移植情况，结果表明无手术史组胰岛提取量平均为3996 IEQ/kg，而术前进行胰腺引流术对胰岛提取量的影响最大，仅为1531 IEQs/kg。该中心的儿童自体胰岛细胞移植病例也表明胰腺手术史对胰岛提取量及术后胰岛素不依赖率影响很大，术前无手术史组患者术后1年的胰岛素不依赖率达到67%，而手术组仅为33%。

3.胶原酶的选择

虽然人的自体胰岛分离技术一直在不断改进，但仍然存在不少问题，提高胰岛分离产量的另一个关键因素是胶原酶的选择，使用不同的胶原酶可影响胰岛细胞的产量和质量。Liberase-HI（LH）酶，是一种高度纯化的低内毒素胶原酶，数据表明该酶能够有效改善分离胰岛的产量和质量，尽管该酶有时会有内部的变异，对分离后的胰岛有部分有害影响，但该酶已广泛用于人体临床胰岛细胞分离。

2007年4月，在LH制造工艺中采用了牛脑源性原料，因此引起了严重关注，因为牛脑源性材料有一个潜在的朊病毒可能会引起传染性海绵状脑病。在这种情况下，SERVA/Nordmark（SN）胶原酶和中性蛋白酶NB取代LH胶原酶，以消除海绵状脑病传染的可能性。SERVA/Nordmark（SN）胶原酶与LH胶原酶相比，优点是它可以作为一个GMP级的试剂，具有更低的内毒素水平，并将胶原酶和中性蛋白酶分别存放，工作浓度时酶的活性更高。

4.移植部位

目前胰岛细胞移植主要选择经门静脉系统和脾脏，因这两个部位移植的胰岛，能获得最大的胰岛素非依赖率。与脾脏相比，将胰岛细胞经门静脉输注所需胰岛的量更少。然而，门静脉移植可引起和移植部位相关的并发症：门静脉压力增高、肝静脉栓塞、肝坏死和弥散性血管内凝血。门静脉压力的增高主要和输注胰岛的体积有关，一般大于50ml即会引起压力增高。而血栓相关并发症主要由于胰岛移植物内混有的胰腺外分泌成分，其释放胰腺凝血酶原激酶引起。

上述提示对于慢性胰腺炎适合胰腺全切除术的患者，应严密监测胰腺的病理变化，研究建议应每6个月进行一次CT或MRI检查以评估胰腺纤维化的程度，将有助于判断进行手术切除并自体移植的最佳时机。同时，对于慢性胰腺炎的患者施行手术时，尤其是进行引流术时应慎重，以免使患者丧失自体胰岛移植的机会。