造血干细胞基因治疗

大多数遗传因素引起的血液病（如先天免疫缺陷、血红蛋白病、代谢紊乱、贫血等）可以通过异体HSC移植进行治疗。基因正常的异体HSC可以在患者体内长期存活，持续生成功能正常的血细胞从而达到长期的治疗效果。但异体HSC移植需要HLA配型相合的供体细胞，HLA不相匹配的HSC移植后往往效果较差，同时容易引起感染、GVHD等并发症，这些问题限制了异体HSC移植的应用。针对不同遗传原因引起的血液学疾病，采用患者自体HSC进行基因操作后再回输给患者可以避免异体HSC移植引起的免疫排斥等问题，有希望获得理想的疗效。

（一）基因治疗相关技术

早期基因治疗主要利用病毒载体将正常基因转入患者细胞中，从而治疗基因缺陷引起的疾病。1990年美国就实施了世界第一例利用逆转录病毒载体在T细胞中导入腺苷脱氨酶基因治疗免疫缺陷的临床试验。不过，由于对病毒生物学特性认识还不够深入，早期基因治疗存在比较明显的副作用甚至导致死亡。近年来，随着对病毒载体、疾病机制认识的加深，基因治疗在安全性、基因递送效率等方面取得明显的进步。

目前，常用的病毒载体主要为逆转录病毒载体(retroviral vectors)和腺相关病毒载体(adeno-associated viral vectors,AAV)。其中逆转录病毒载体又包括γ-逆转录病毒以及慢病毒(lentiviral vectors)载体。逆转录病毒将外源基因随机整合至基因组中，转染成功的细胞可以长期表达外源基因。不过，由于逆转录病毒整合至基因组后可能引起致癌性突变，在载体优化去除逆转录病毒载体的内源性强增强子元件后有助于提高病毒载体的安全性。γ-逆转录病毒的缺点是其介导基因转导需要宿主细胞进入有丝分裂期，对HSC细胞这样处于相对静止状态的细胞感染效率不高。因此，利用γ-逆转录病毒对HSC进行基因转导时需要体外培养HSC较长时间以便病毒介导基因导入，但体外长时间培养HSC导致细胞多能性丢失从而影响HSC移植后的治疗效果。慢病毒载体可以感染非分裂的细胞，携带外源基因的容量比γ-逆转录病毒更大，因此HSC细胞的基因转导更倾向利用慢病毒载体。AAV病毒载体是非整合型载体，转染的外源基因以附加体形式在细胞内稳定存在，因此AAV载体的安全性较高。AAV病毒载体适合以in vivo方式直接在体转染外源基因表达。Manno等报道利用携带凝血因子Ⅸ的AAV病毒治疗血友病B患者，最初由于机体的抗AVV病毒免疫，外源基因在患者体内表达持续时间很短。在对AAV病毒载体衣壳蛋白以及基因表达阅读框序列进行优化后，治疗效果得到了显著提升。

病毒载体介导的基因转染在临床治疗上已经取得了一定的进展，但由于病毒整合可能引起致癌性突变以及外源基因表达的调控存在难点，导致这项技术仍存在一定的风险。近年来发展起来的基因编辑技术可以实现基因组定点基因插入、敲除或修复，排除了随机整合引起的突变问题，同时可以实现内源性的基因表达调控，成为基因治疗方向新的研究热点。基因编辑技术首先利用识别特异性位点的核酸内切酶在基因组突变位点附近切割引入DNA双链断裂，然后细胞启动双链DNA断裂修复，通过非同源末端链接(non-homologous end joinin,NHEJ)或同源重组修复机制(homologydirected repair,HDR)修复双链DNA断裂。在修复过程中，NHEJ可以在双链DNA断裂处引入一小段缺失突变，从而灭活靶基因。HDR修复还可以利用额外转入的同源DNA序列进行同源重组修复，从而实现突变基因的修复或者在DNA双链断裂处定点插入新的基因序列。目前，基因编辑中常用的核酸内切酶主要有以下三种：

1.锌指核酶(zinc finger nucleases,ZFNs)

ZFN由一个DNA识别结构域和一个非特异性的核酸内切酶(Folk I)组成。DNA识别结构域中包含串联的3～5个可以识别并结合特异性碱基三联体的锌指蛋白。当一对锌指核酶分别识别并结合到基因组上相邻部位的DNA上后，其携带的核酸内切酶互相靠近形成有活性的核酸内切酶二聚体，在ZFNs结合部位引入DNA双链断裂。ZFN的缺点是构建比较麻烦，同时容易产生脱靶效应。

2.转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALENs)

TALEN功能与ZFN类似，也是一段DNA识别区结合FokI核酸内切酶。不过TALEN采用不同的DNA序列识别机制。TALEN包含14～20个TAL效应因子(TAL effector,TALE)，每个TALE元件包含33～35个氨基酸残基，其中包含2个高变异度的残基(repeat variable diresidues,RVD)，RVD决定TALE元件识别的碱基对，将TALE模块串联后形成识别特异性的DNA序列的结构。相比ZFN,TALEN的构建操作容易一些。

3.CRISPR-Cas9

CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，是细菌抵御病毒入侵的适应性机制。CRISPR/Cas9系统作为基因编辑工具时包含sgRNA和Cas9核酸内切酶两个元件，sgRNA 5'端为20bp与靶基因互补配对的序列，随后是crRNA和tracrRNA形成的发夹结构，sgRNA的发夹结构与Cas9核酸内切酶结合后识别特定DNA序列进行切割形成双链断裂。由于CRISPR-Cas9技术操作简单灵活，目前已经被广泛用于基础和临床应用研究，成为最热门的生物学技术，同时CRISPR技术还衍生发展出多种新型的基因编辑技术，极大地丰富了基因编辑技术的手段。

（二）造血干细胞基因治疗的策略

由于HSC在体内长期存活，并且可以分化为所有的血液细胞，利用患者自体HSC细胞在体外进行基因修饰后再回输给患者，不仅可以避免免疫排斥的问题，而且可以实现长期的治疗效果，因此HSC是基因治疗较为理想的靶细胞。自体HSC可以通过采集经G-CSF动员后的外周血，然后进行基因编辑治疗不同的疾病。目前常用的基因编辑策略有以下几种：

1.基因敲除

某些疾病通过敲除基因的调控元件、病毒受体或者病原基因就足够改善病情，这种条件下可以通过基因编辑技术在HSC疾病基因片段上形成双链断裂，然后通过NHEJ途径完成DNA修复的同时使疾病基因失活。例如，BCL11A基因抑制胎儿血红蛋白(HbF)的表达，在镰刀型细胞贫血或地中海贫血中，通过基因编辑破坏BCL11A基因增强子活性，抑制BCL11A的表达，可以提升细胞内HbF基因的表达，从而减轻贫血的症状。另外，HIV-1病毒以趋化因子受体5(chemokine receptor 5,CCR5)作为辅助受体感染人类免疫细胞。在治疗白血病时发现移植携带CCR5Δ32缺失突变纯合子的异体HSC后，可以同时防止HIV的进一步感染。通过基因编辑ZFN技术可以敲除CD34+HSC细胞中CCR5基因，敲除CCR5的HSC在移植至免疫缺陷小鼠体内后可以重建小鼠造血并能防止HIV再感染，从而证明通过人工构建CCR5基因突变有希望治疗HIV感染。在HIV的基因编辑治疗上，北京大学邓宏魁教授和中国人民解放军总医院第五医学中心陈虎教授合作利用CRISPR-Cas9对CD34+HSC进行基因编辑敲除CCR5基因，并且开展了临床试验(NCT03164135)。2019年，该团队在新英格兰医学杂志报道了首例利用CRISPR-Cas9在HSPC中编辑CCR5基因并成功移植到同时患有HIV和急性淋巴细胞白血病的患者案例，HSPC移植治疗使患者的急性淋巴白血病得到完全缓解，同时携带CCR5突变的供体细胞能够在患者体内长期存活达19个月，初步探索了该方法的可行性和安全性。只是，CCR5突变的细胞在患者体内占比仅有5%，抵抗HIV感染的效果还不明显，需要进一步优化治疗方法[插图]。

2.基因修复

在一些单基因突变引起的疾病中，可以通过基因编辑修复突变基因从而达到治疗的效果。这种方式通过在基因组中定点引入双链断裂，同时提供正确的同源DNA片段作为模板，细胞在利用HDR方式进行DNA修复时同时利用正确的片段替换基因组中突变的序列，从而达到基因修复的效果。利用这种方式可以修复引起镰刀型细胞贫血的β-珠蛋白基因突变或者恢复地中海贫血中β-珠蛋白基因的表达[插图]。

3.基因插入

当疾病相关基因存在多位点突变时，基因编辑可能无法有效完成多个位点的同时修复，这种情况可以通过基因编辑定点插入正确基因的DNA序列，从而弥补突变基因的功能缺失。例如，可以采用这种方式对HSC进行基因编辑在染色体上定点插入IL2Rg基因治疗X连锁严重联合免疫缺陷病(X-linked severe combined immunodeficiency,X-SCID)。利用基因编辑的方法可以将外源基因准确插入到基因组中相对安全的位点，相比病毒载体随机整合导入基因的方法更安全。

（三）造血干细胞基因治疗面临的问题

近年来，随着HSC分离纯化、体外培养和移植技术以及基因编辑技术的不断优化，HSC基因治疗已经在多种疾病的治疗上展现出良好的效果。但目前仍存在一些问题需要攻克：

首先，HSC处于生长静止期(quiescent)，大多数细胞处于细胞周期的G0/G1期，这给基因编辑带来很大的问题。由于DNA同源重组修复机制(HDR)需要细胞处于S/G2期，因此在利用核酸内切酶在基因组定点形成双链断裂后，细胞更倾向利用NHEJ机制进行DNA修复，这会造成外源同源模板插入基因组的效率很低。目前在对HSC进行基因编辑前通常会采用SCF、TPO、Flt3L等造血细胞因子促进细胞增殖，但HSC体外增殖会导致多能性的降低，减弱HSC移植后植入骨髓的效率。

其次，基因治疗过程中常采用病毒载体进行基因的导入，但病毒载体存在安全性问题以及免疫原性问题，影响基因导入的效率。HSC在体外进行基因修饰时，电穿孔技术也是常用的方式，但HSC在经过电穿孔后往往产生较大的细胞毒性，影响细胞的活力。因此，目前HSC基因治疗中使用的基因递送技术还需要进一步研究和优化。

近年来，很多研究在努力攻克造血干细胞体外培养的难题，解决这一关键性难题将会极大的促进造血干细胞基因治疗技术的应用。