造血干细胞自我更新

在人体发育过程中，HSC最早期出现于卵黄囊(yolk sac)，胎儿时期存在于肝脏，出生后逐渐转移至骨髓。骨髓中的HSC可以通过对称分裂(symmetric cell divisions)的方式生成2个HSC或2个造血祖细胞(progenitor cell)，也可以通过非对称分裂(asymmetric cell divisions)方式形成1个HSC和1个造血祖细胞，从而维持HSC数量的稳定。正常情况下，体内大部分HSC处于静止(quiescent)状态，在当机体受到不同因素（如失血、射线、移植等）的刺激后，HSC可以进入细胞增殖状态，从而促进机体造血功能的恢复。HSC的自我更新受到细胞内外多种因素（如：细胞微环境、转录因子、细胞和生长因子、代谢调控）的协同调控，这其中涉及的调控问题一直是HSC研究的热点，同时也是难点。

（一）造血干细胞微环境

造血干细胞微环境(niche)的假说最早是由Ray Schofield提出的。骨髓中的基质细胞、脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞等共同构成了HSC生存的微环境(niche)，HSC通过接受微环境中各种抑制性或刺激性信号分子以及细胞间的相互作用维持自我更新、细胞动员、植入或分化的平衡。组成niche的细胞包括血管周细胞(perivascular cell)、内皮细胞(endothelial cell)、成骨细胞(osteoblasts)、网状细胞(reticular cell)、神经元等。解剖学上，人体骨髓主要存在于长骨的骨髓腔中，骨髓腔内表面覆盖着由成骨细胞、破骨细胞(osteoclasts)和网状结缔组织支持的骨衬细胞(bone-lining cells)组成的骨内膜，HSC在骨髓中主要位于骨内膜区域，存在于骨内膜区域的HSC相比存在于骨髓其他部位的HSC具有更强的自我更新能力。静止期的HSC则特异性的存在于骨髓中靠近血管区域形成的血管周微环境(perivascular niche)中[插图]。体外实验结果显示，间充质干细胞分化来的成骨细胞可以产生造血相关的细胞因子维持原始造血细胞(primitive haematopoietic cells)。在基因修饰的小鼠中增加成骨细胞的数量，HSC的数量相应也增加。骨髓中nestin阳性的MSC分布在血管周围，表达高水平的SCF和CXCL12，维持HSC的稳定。趋化因子CXCL12维持骨髓中HSC的稳定，敲除MSC中CXCL12的表达将导致HSC的耗竭。CXCL12的表达还受到交感神经系统的控制，从而对HSC的动员入血进行周期性的生理调节[插图]。内皮细胞则分泌多种因子促进HSC的自我更新。血管内皮细胞对HSC在血窦(sinusoids)中的维持发挥着重要作用，并且对骨髓移植后造血重建过程是必须的。条件性敲除内皮细胞中GP130细胞因子受体基因会导致骨髓功能紊乱和HSC细胞数量的减少[插图]。骨髓中还包括其他多种细胞，例如：脂肪细胞通过分泌激素、脂肪酸等影响邻近细胞的功能。还有文献报道小鼠中脂肪细胞分泌瘦素(leptin)增加造血功能，不过也有报道认为脂肪细胞是HSC的负调控因素。这些研究显示骨髓微环境并不是均一的，不同类型的造血前体细胞受到骨髓中相对特异性的局部微环境调控。HSC如何在复杂的骨髓微环境中保持自我更新和造血分化的平衡还需要更多的研究。

（二）造血干细胞自我更新的调控

HSC的自我更新受到细胞内外多种信号通路的协同调控，目前的研究主要集中在HSC细胞内转录因子的调控以及胞外细胞因子的作用机制这两方面。

1.内在转录因子调控

早期通过基因敲除实验或者过表达外源基因的方法，发现多个转录因子与生理状态下HSC的发育调控相关，如SCL、GATA-2、Lmo-2、AML-1等转录因子是原始造血细胞形成的必须因子。在HSC自我更新方面，Hoxb4过表达的HSC在体内的扩增能力显著高于对照细胞，连续移植实验显示Hoxb4过表达的HSC重建造血的能力明显增强。此外，HoxA和HoxB家族其他成员（如HoxA4、HoxA9、HoxB6）也参与成体HSC的命运调控。Polycomb group(PcG)家族蛋白通过染色质修饰抑制靶基因的表达，研究发现PcG家族蛋白Ezh2和Bmi1[插图]能促进HSC自我更新并防止细胞耗竭。另外，包括微小RNA(micro RNA)在内的非编码RNA也参与HSC的命运调控，如miR-125家族以及miR-29a等。这些研究为HSC调控的内在机制提供了大量的信息，不过通过在HSC中过表达转录因子的方法虽然可以促进细胞的自我更新，同时也可能引起细胞表型的转化。寻找自然状态下HSC关键转录因子的调控规律，进而通过外源因子直接调控HSC相关转录因子的表达，促进HSC的自我更新，将对HSC体外扩增体系的建立提供更大帮助。

2.HSC的信号调控

HSC微环境中的细胞分泌多种细胞因子和生长因子调控HSC的自我更新和分化。这方面的研究最早来自对W strain和Sl strain这两种突变小鼠的研究。W位点位于5号染色体，Sl位点位于10号染色体，这两种突变小鼠的表型主要为贫血，缺乏肥大细胞、黑色素细胞以及生殖细胞。当将正常骨髓细胞移植到W突变小鼠后可以完全恢复造血，而移植到Sl突变小鼠时，造血功能仍不正常。而将W突变小鼠的骨髓移植到野生型小鼠或Sl突变小鼠时，造血功能均不能恢复正常。反之将Sl突变小鼠骨髓移植到W突变小鼠后，造血系统可以恢复正常。这些实验结果促进了关于HSC与niche细胞相互作用的认识。1990年左右，W和Sl突变位点中的关键基因相继被克隆，W位点中的关键基因编码c-Kit，而Sl位点中的关键基因编码stem cell factor(SCF)，也称steel factor或kit-ligand。此后，通过基因敲除实验又发现多种细胞因子及受体调控HSC的功能。在这其中，调控HSC功能最关键的两种细胞因子/受体组合是SCF及其受体c-Kit和血小板生成素(thromopoietin,TPO)及其受体c-Mpl。HSC表达c-Kit和c-Mpl这两种受体，任一基因的突变将导致HSC数量减少。与此相对应，SCF和TPO可以促进HSC的体外扩增。这些研究显示SCF和TPO是HSC的正向调控信号。除了SCF和TPO，随着HSC分离以及重组蛋白技术的进步，还发现其他多种细胞因子（包括：IL-3、IL-6、IL-11、Flt-3 ligand等）对HSC的自我更新有一定促进作用。不过，在这些细胞因子作用下，经过体外培养的HSC逐步丢失长期造血功能。而且有研究报道，HSC并不表达Flt-3受体，而IL-11受体基因敲除的小鼠具有正常的造血功能，提示这两种因子可能不是HSC自我更新的关键调控因素。

HSC的另一个特性是在体内主要处于静止状态，在需要时进入细胞增殖状态进行自我更新或分化从而促进造血。TGF-β信号在维持HSC细胞静止状态和增殖状态的平衡过程中起着一定的作用。体外培养时，TGF-β信号能抑制HSC细胞的增殖，TGF-β可以改变HSC细胞因子受体的表达，并且上调细胞周期激酶抑制剂（如p21、p57）的表达。不过，体内实验显示TGF-βⅠ型受体基因敲除的小鼠具有正常的造血功能，体内TGF-β的研究结果与体外研究还是存在一定的差异。同时由于TGF-β的作用非常广泛，通过体内实验来验证TGF-β信号对HSC的调控作用还是存在一定的困难。除了TGF-β信号，另一调控HSC静止的信号分子是血管生成素-1(angiopoietin-1,ang-1)及其受体Tie2。HSC表达Tie2,Tie2的表达对造血没有影响，但是Tie2对维持成人骨髓中HSC的稳定是必需的。生理条件下，表达Tie2的HSC处于静止状态，在骨髓中与表达Ang-1的成骨细胞相邻。体外培养条件下，Ang-1抑制HSC的增殖。这些研究表明Ang-1/Tie2信号通路参与维持HSC静止状态的调控。

除了造血相关细胞因子，大量研究显示Wnt信号在HSC的自我更新中发挥重要调控作用。HSC微环境中的细胞表达Wnt蛋白，在HSC培养液中添加Wnt3a或Wnt5a可以增强HSC的自我更新。Wnt信号激活后可以稳定细胞内的β-catenin水平，促进βcatenin进入细胞核激活下游基因的表达。而在HSC中过表达β-catenin可以上调HoxB4以及Notch1的表达，促进HSC的扩增。另外，Perry等报道利用GSK3抑制剂CHIR99021激活Wnt信号通路结合PTEN抑制剂以及细胞因子SCF和TPO的作用可以维持LT-HSC的功能。不过Wnt下游信号通路非常复杂，其下游TCF/LEF分子的表达水平直接影响Wnt信号通路的最终结果。有研究报道低水平的Wnt信号促进HSC的扩增，而高水平的Wnt信号会导致HSC细胞耗竭。

Notch信号是另一条非常保守的信号通路，哺乳动物有4种Notch受体(Notch1-4)和5种配体（DLL1、DLL 3、DLL4和Jag1、Jag2），在发育、细胞命运决定、造血等过程中发挥关键调控作用。文献中报道的Notch信号通路对HSC的调控作用也有些矛盾结果。有文献报道Notch配体Delta1与SCF、IL-6、IL-11以及Flt3协同调控HSC的自我更新和分化，而内皮细胞促进HSC自我更新的作用依赖Notch信号。不过，也有文献报道Notch信号对HSC的自我更新不是必须的，其下游靶基因在生理条件下处于低水平的表达状态，Notch可能更多的与应激状态下HSC的造血调控有关。

另外，Sonic hedgehog(Shh)信号通路也参与HSC的调控，并且Shh的作用依赖其下游BMP4信号，抑制BMP4信号通路可以阻断Shh促进HSC扩增的作用。其他对HSC扩增有调控作用的因子还包括FGF、IGF、多效生长因子(pleiotrophin)、血管生成素样蛋白(angiopoietin-like proteins)等。

总体来说，已有的体内外实验为理解HSC自我更新的调控机制提供了越来越多的信息。但由于现有的培养条件还不能长期维持HSC体外自我更新，对于HSC的自我更新调控机制仍不明确，相信随着更多系统生物学方法在HSC研究中的应用，对HSC的调控机制会有更加全面的认识。

（三）造血干细胞的体外扩增

HSC的来源问题极大地限制了其在基础研究以及临床上的应用，建立体外HSC的培养体系一直是HSC研究的目标。通常体外培养造血细胞的目的主要有：

①制备具有重建长期造血功能的LT-HSC(longterm hematopoietic stem cell)用于移植治疗；

②扩增STHSC(short-term hematopoietic stem cell)及祖细胞用于移植后快速恢复血细胞数量；

③生成各种成熟的血细胞；

④对体外培养的造血细胞进行遗传修饰用于基因治疗；

⑤利用体外培养的细胞研究造血细胞的调控机制以及药物筛选。造血细胞可以在不同的刺激条件下扩增，依据不同目的使用不同的培养体系最终获得的细胞在组成和生物学特性上将有很大不同。这其中的核心问题就是对HSC自我更新调控机制的认识。关于HSC的体外扩增，以往主要从以下几方面开展研究：

首先，体内HSC的命运受到骨髓微环境中细胞的调控，利用不同细胞为HSC提供适当的微环境有利于HSC的扩增培养。体外共培养实验显示基质细胞、MSC以及内皮细胞等可以促进共培养HSC的自我更新，提升最终获得CD34+细胞的数量。早在1990年，Fraser等就报道利用基质细胞培养HSC的方法证明HSC体外扩增能力，但经过4周培养，具备重建造血能力的细胞逐步减少，表明这种条件仍不是最佳。间充质干细胞通过细胞间接触以及分泌细胞因子促进人HSC的自我更新。一期临床试验证实了间充质干细胞共培养的HSC在移植后的安全性没有问题，并且移植与MSC共培养的HSC后能更快地恢复中性粒细胞以及血小板的功能[插图]。考虑到MSC已经在临床上获得广泛的应用研究，MSC细胞来源与制备也相对简单，在最终建立稳定的HSC培养体系前这种方法值得尝试。

其次，HSC所存在的微环境中包含多种细胞因子，不过目前还没有发现哪种细胞因子在单独应用时能对HSC的增殖产生显著的作用，因此体外培养HSC时常采用多种细胞因子组合的方法。常用的细胞因子组合包括：SCF、TPO、Flt3L、IL-3、IL-6等。HSC表达SCF的受体c-kit，在c-Kit突变小鼠模型或者用抗体封闭c-Kit结果显示c-kit功能缺失将引起胚胎致死以及造血细胞缺失，同时SCF也能促进体外培养HSC的存活。TPO与SCF以及IL-3协同作用可以有效地促进HSC的扩增，缺失TPO受体Mpl的HSC将丧失重建造血的能力。不过，目前这些组合不同细胞因子的培养方法只能调控HSC短期的存活和增殖，不能长期维持HSC的功能，现有体外条件培养的HSC在细胞数量增加的同时HSC的多能性也逐步丢失。

另外，近年来，小分子化合物在干细胞中在作用受到越来越多的关注，利用小分子化合物来促进HSC的增殖，同时减少HSC细胞的衰老和耗竭也是研究的方向之一。在HSC的体外扩增上，Cooke等报道在含有TPO,SCF,Flt3L以及IL-6的培养液基础上进一步筛选小分子库，最后发现嘌呤类衍生物Stem Regenin 1(SR1)可以促进人脐带血来源的CD34+细胞的扩增，临床研究显示SR1可以促进HSC的恢复造血功能。不过，对SR1培养的CD34+细胞的表型分析显示SR1主要还是促进多能祖细胞和红系/巨核细胞扩增，而非LT-HSC。2014年，Sauvageau等报道嘧啶吲哚衍生物UM171可以促进HSC的自我更新并保持长期造血潜能，而且可以增加HSC体外转基因的效率。目前已有利用UM171进行异体造血干细胞的扩增研究开展临床试验(NCT02668315)。

小分子化合物还可以通过表观遗传调控在ES或HSC的命运决定中发挥调控作用。例如，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂丙戊酸(valproic acid)可以上调人脐带血CD34+细胞干性基因HOXB4的表达，下调P21，促进细胞周期进展，同时促进细胞在移植到SCID小鼠后的归巢和扩增。Araki等报道利用5AZA/TSA（5aza-2deoxycitidine和trichostatin A）处理HSC可以增加CD34+HSC的扩增，同时造血干细胞相关转录因子HOXB4,BMi1和GATA2表达水平上升[插图]。甲基转移酶G9a和GLP通过哺乳动物发育过程中组蛋白H3K9的单甲基化或二甲基化状态调控基因的表达，Chen等报道赖氨酸甲基转移酶G9a和GLP的抑制剂Unc0638可以抑制体外培养的HSC进一步分化，更好的保持干细胞的表型和功能。

在HSC的体外扩增研究方面，除了已经提到的这些因素，其他还有很多因素可能影响HSC的自我更新，包括氧浓度、细胞外基质环境、离子浓度等。总体来说，目前的这些培养条件还有待优化。虽然已有多种因子可以促进体外培养的HSC数量增加，但大多数情况下培养所获得的细胞中分化的细胞占多数，可以用于移植的原始造血干细胞含量不高。由于体外培养的HSC往往与新鲜分离的HSC在表面标志上存在很大的差别，目前还没有可靠的标志用于鉴定体外培养HSC的活性和功能，这也不利于体外培养体系的探索和研究。随着对HSC自我更新理解的加深以及高通量筛选平台的应用，这些问题有可能在不久的将来获得突破。