抗原的负载

DCs通常可负载多肽、蛋白质、RNA或自体/异源肿瘤细胞。多肽可以直接负载在DCs表面的MHC分子上，而蛋白质和肿瘤细胞需要加工成多肽后再负载到MHC分子上。在临床试验中，通常使用8～15个氨基酸并与CD8+T细胞的MHC结合的抗原表位短肽作为TAAs。但是，使用短肽需要了解患者的HLA单倍型以及与这些特定单倍型结合的抗原表位。近来，28～35个氨基酸合成的较长多肽被用来负载到DCs上。该多肽的长度合适，可优先被DC通过交叉呈递吸收、处理和呈递，从而激活CD8+T细胞应答以及CD4+T细胞应答。在一项临床试验中，将HPV-16 E6和E7序列全长的多肽在Montanide ISA-51佐剂中乳化后，再输注到晚期HPV-16+宫颈癌患者中，结果表明，该疫苗安全且具有免疫原性。在另一项研究中，接种Montanide ISA-51佐剂的HPV-16多肽疫苗的患者中有79%在12个月后出现客观反应，而且在原始病变中未再检测到HPV。基于以上研究，研究者在宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌和HIV感染中进一步证实了使用较长的多肽疫苗制剂可有效诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞的免疫应答。

负载有蛋白质、自体/同种异体完整肿瘤或肿瘤细胞系裂解物的DCs也已经用于治疗多种癌症。此方法的主要优点是：

①不同单倍型的MHC分子可以结合多种抗原表位，具有诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞对多种抗原反应的潜力；

②在加工抗原的过程中，可延长抗原的呈递时间，以增加肿瘤细胞的损伤相关的分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)的暴露/释放，进而增强DC的成熟、提高免疫原性。通过多次冻融循环的方法来杀死自体或同种异体的全肿瘤细胞或肿瘤细胞系可有效地释放内源性DAMPs。将负载经多次冻融循环产生的次氯酸氧化的自体全肿瘤裂解物后的DCs回输到患者体内，可在卵巢癌患者中检测到有效的CD4+T细胞和CD8+T细胞的免疫应答。另外，也有临床试验使用聚乙二醇将自体多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞和DCs融合，以使DCs获得大量的肿瘤抗原；疫苗接种后，大多数患者获得了抗肿瘤免疫反应，疾病趋于稳定。目前，大规模的临床试验正在探索抗原负载的更有效的方法。

另一种抗原负载的方法是利用细菌或病毒载体将肿瘤抗原稳定表达于DCs中。细菌载体如卡介菌(Bacillus Calmette Guerin)、单核细胞性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门菌(Salmonella)和志贺菌(Shigella)；病毒载体如金丝雀痘病毒(Canarypox virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、黄热病毒(yellow fever virus)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus)和慢病毒(lentivirus)等。上述载体均已证实可有效的进行抗原负载。使用细菌或病毒载体负载抗原的优势在于：

①将细菌或病毒的编码毒性或复制因子的基因去除，以保障其安全性；

②编码TAAs的基因整合入DCs的基因组，使DCs稳定呈递抗原；

③有效诱导DCs的成熟。使用编码Melan-A/Mart-1表位的已经死亡但具有代谢活性(killed but metabolically active,KBMA)的单核细胞性李斯特菌感染人DCs，在体外实验中可成功诱导DCs的成熟，并激活Mart-1特异性CD8+T细胞，从而裂解患者的黑色素瘤细胞。将携带有NY-ESO-1全长的经KBMA处理的单核细胞性李斯特菌直接静脉输注小鼠体内，可有效呈递抗原至包括DCs细胞的APCs，并激活T细胞。然而，将载体直接呈递到患者体内可能不能持续诱导机体的免疫应答。使用慢病毒载体将抗原转导至DCs可有效激活机体免疫，且表现出多种优势。慢病毒载体可转导由CD14+或CD34+前体细胞分化而来的不分裂的MDDCs细胞。将携带有共表达GM-CSF/IL-4和黑色素瘤抗原的慢病毒转入CD14+单核细胞中，制备成“SmartDCs”，该细胞可自行分化成髓系来源的APC细胞。体外研究表明，SmartDCs可以高水平表达CD80、CD86，并诱导T细胞产生抗原特异性免疫应答。

另外，可用编码TAAs的mRNA转导DCs，产生的DCs可诱导机体特异的免疫应答[插图]。可以使用阳离子脂质体DOTAP或电转来完成mRNA转导DCs。其中，电转是目前公认的转导mRNA最有效的方法。使用携带编码CD40L和HIV抗原的mRNA电转入自体DCs所制备的DC疫苗被证明是安全的，并且能够诱导HIV特异性免疫反应。一项Ⅱ期临床试验将扩增的肿瘤RNA和合成的CD40L RNA(AGS-003)共电转入DCs，并与舒尼替尼(sunitinib)联合用于治疗转移性透明细胞肾细胞癌，结果表明该疫苗具有良好的耐受性，临床显示62%的患者受益。

DC疫苗所针对的抗原包括病毒抗原、癌胚抗原、过表达的抗原以及分化抗原[插图]。通过高通量测序，可以鉴定肿瘤组织中编码蛋白区的基因突变，并发现新的靶抗原。这些新抗原在正常组织中不表达，因此可以诱导激活抗原特异的初始T细胞(naïve T cell)。已有临床试验证实，使用IFN-γ、poly-I:C和R848刺激、与GMP级K562-CD40L饲养层细胞共培养后成熟的DCs，负载黑色素瘤中错义突变的新抗原肽，可引发或增强HLA-A2限制性CD8+T细胞的免疫应答(NCT00683670)。使用环磷酰胺和免疫检查点抑制剂进行预处理以消除或减少Tregs，以及通过静脉输注DCs使其快速转运至次级淋巴组织等方案可增加临床疗效。尽管全外显子测序和表达谱测序分析表明，具有高突变负荷的肿瘤具有更多的CD8+T细胞，而且肿瘤的突变负荷与NK/CD8+T细胞的杀伤能力相关。但是，肿瘤突变负荷与患者预后并非正相关。目前显示，黑色素瘤患者和肺癌患者的肿瘤突变负荷越高，使用免疫抑制检查点抑制剂的疗效越好，如PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂。因此，尚需进一步的临床试验验证突变抗原的免疫原性与常规抗原的免疫原性的区别。鉴于仅有部分新抗原具有免疫源性，因此需要进一步完善预测工具，以鉴定可以引发CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫应答的高亲和力免疫原性新抗原。

正如前文提到的，DCs可以呈递非常规抗原，如磷酸化多肽、瓜氨酸化肽以及源自癌细胞中表达的非编码DNA的抗原等。而非编码DNA的抗原包括内源性逆转录病毒残余表达的抗原，这种抗原是否属于DC疫苗中有效的抗肿瘤抗原，有待进一步观察。