NK细胞治疗

1.NK细胞的扩增

由于外周血中NK细胞占淋巴细胞的比例只有10%～15%，含量稍丰富的脐带血NK比例最多也只能达到30%左右，远不能满足治疗的需要。因此，如何有效扩增NK细胞是一个关键问题。最初多采用IL-2、IL-15等细胞因子进行激活：在输注NK细胞前，使用1 000IU/ml的IL-2刺激8～16小时能够显著激活NK细胞，但是由于IL-2基本上可以激活T细胞的所有亚群，因此其也能刺激Tregs的增殖。也可使用IL-15对NK进行激活。IL-15与IL-2的受体共用β和γ链，因此IL-15具有与IL-2类似的生物学活性，激活NK细胞成熟的同时延长其生存时间。虽然每种细胞因子刺激的时间和效果各有不同，但都能在一定程度上提高了NK细胞的增殖能力及杀伤活性。在此基础上，许多研究同时运用多种细胞因子如IL-2、IL15、FLT3L等联合使用，或者IL-12、IL-15、IL-18等联合使用，都能在一定程度上激活NK细胞。

另外，使用饲养层细胞可促进NK细胞的快速增殖及大规模扩增。目前，用于刺激NK细胞增殖的饲养层细胞是过表达了膜结合型IL-15(membrane bound-IL15,mbIL-15)和4-1BBL的K562细胞系。与分泌型的IL-15相比，mbIL-15能更好地刺激NK细胞的增殖。4-1BBL与NK细胞表面的共刺激分子4-1BB结合，同样可以刺激NK细胞增殖。研究发现，经过100Gy X射线照射的饲养层细胞系与NK细胞共培养3周后，NK细胞的数量实现了超过1 000倍的扩增，优于仅用细胞因子刺激的效果。后来的研究在此基础上进行了改进，目前主要有两种方式，第一种是将mbIL-15改成了mbIL-21，这是因为K562-mbIL15-4-1BBL刺激的NK细胞在体外培养过程中会出现端粒长度缩短，细胞老化的问题。而K562-IL-21-4-1BBL在增强NK细胞扩增能力的同时，避免了这一缺陷，因此得到了更加广泛的运用。除了使用X射线诱导饲养层细胞死亡，另外一种破坏饲养层细胞的方式利用了超声波的空化作用，提取饲养层细胞的细胞膜并将其改造成质膜囊泡。这种质膜囊泡不仅可以做成现货试剂保存起来，而且无须照射。更为重要的是，其他的扩增NK细胞的方式都是体外扩增，而过长的体外扩增可能导致NK细胞失去归巢能力。而这种微粒可以通过注射的方式，实现NK细胞的体内扩增。在刺激NK细胞扩增方面，这种质膜囊泡能否能够达到与完整的饲养层细胞相同的效果仍然有待进一步验证。

图　原代NK细胞的诱导扩增

其他研究者同时也会给K562-mbIL15-41BBL细胞系表面同时过表达CD64、CD86等分子进一步刺激NK细胞的激活。但是无论选择哪一种饲养层细胞，都需要保证K562在X射线照射之后不再增殖、NK细胞扩增完毕后没有K562细胞存活。值得注意的是，不同刺激方式不仅会影响NK细胞的产量，也会影响其表型，比如与单独使用IL-2刺激的NK细胞相比，采用饲养层细胞刺激的NK细胞CD25、NKG2D和NKp46的表达都会增加。

2.目前临床应用状况

由于NK细胞本身具有杀伤肿瘤细胞的功能，因此，临床上可以采用直接输注NK细胞进行过继治疗。然而，如前所述，NK细胞功能的发挥需要其表面抑制性受体和激活性受体的协同作用。因此，阻断NK细胞的抑制信号以及激活NK细胞的活化通路可以更好地发挥NK细胞的细胞毒作用。目前关于NK细胞的疗法主要可以分为以下几类：

(1)HSCT与NK细胞的过继转移：

HSCT在血液肿瘤的治疗中应用广泛，其主要原理是基于移植物中T细胞或者NK细胞介导的移植物抗白血病反应(graft-versus-leukemia,GvL)。然而，异体T细胞可能会造成移植后出现GvHD，而NK细胞不会引起GvHD，也有研究显示，NK细胞可以通过靶向受体的DCs从而阻止GvHD的发生。在HSCT之后，NK细胞数量和功能的快速恢复往往与良好预后相关。对于一些含有TP53突变的不容易被传统化疗药物杀灭的肿瘤细胞，NK细胞也能起到良好的杀伤效果。

NK细胞的过继疗法的前身是输注LAK细胞。LAK细胞，即淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokineactivated killer cell)，是将外周血单个核细胞经IL-2激活3～5天之后形成的异质性细胞群，其表型不一，但往往具有NK细胞样标志（CD56和CD16）。单独应用LAK细胞治疗效果不佳，需要与大剂量IL-2联合应用。但大剂量IL-2容易引起毛细血管渗透综合征以及肝毒性。单纯的NK细胞输注可以避免这一缺点，如前所述，NK细胞的来源可以有很多种：自体NK细胞，异体NK细胞，NK细胞系等。自体NK细胞比较安全，但是有研究显示，自体的NK细胞在体内的肿瘤微环境中可能会被诱导处于免疫抑制的状态，导致其表型和功能受损，杀伤效果不佳，而采用供者来源的NK细胞可以在一定程度上解除这种抑制，而且其来源更加广泛，因此目前临床试验中，更多的是采用供者来源的NK细胞。

NK-92细胞系是唯一投入临床使用的NK细胞系，其与原代NK细胞相比，不需要复杂的分离纯化刺激等过程，大大简化了制备的工艺流程。但是因为细胞系具有无限增殖的特点，NK-92细胞直接输注到患者体内会有生成次生肿瘤的风险，因此在输注前必须用射线进行照射，使其在保持一定的杀伤活性的同时，又不会继续增殖。

(2)NK细胞激活受体的活化：

CD16是NK细胞表面的一个重要的活化性受体，其介导的ADCC作用在肿瘤免疫中发挥着重要作用。由于CD16a与IgG1和IgG3具有较高的亲和力，因此，科学家们设计了能够增强ADCC作用的单克隆抗体。如利妥昔单抗是靶向CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，由于CD20抗原高表达于B细胞来源的恶性肿瘤，可以利用利妥昔单抗特异性靶向杀伤肿瘤细胞。然而，由于CD20抗原在B细胞分化的多个阶段都有表达，所以治疗过程中正常B细胞也被杀伤，但是这个过程是一过性的，大部分患者会在半年后恢复。目前临床上广泛应用利妥昔单抗治疗NHL和CLL。同样靶向CD20抗原的还有阿托珠单抗(obinutuzumab)，这是一种全人源化的IgG1抗体，识别独特的CD20表位，而且通过糖基化技术增加了抗体与CD16a的亲和力，因此可以增加ADCC作用。

elotuzumab是人源化的IgG1单抗，可特异性靶向作用于SLAM-7，而SLAM-7主要存在于NK细胞、浆细胞和骨髓瘤细胞表面，可通过活化SLAM-7通路以及ADCC作用杀伤靶细胞，目前广泛应用于MM的治疗，而且并未显示出对NK细胞的细胞毒性。

4-1BB作为一个重要的共刺激分子，在T细胞和NK细胞的激活中具有重要作用。其激活型抗体，Urelumab和Utomilumab也已经进入临床试验。Urelumab激活4-1BB的同时并不阻断4-1BB和4-1BBL的结合，但是在临床试验中显示出了肝脏毒性。而Utomilumab再激活4-1BB的同时，可阻断其与配体的结合，且激活作用较弱，但是初步临床数据显示其更高的安全性。

在单抗的基础上，研究者还设计了双特异性NK细胞衔接器(bispecific NK-cell engager,BiKEs)和三特异性NK细胞衔接器(tripecific NK-cell engager,TriKEs)。其本质是含有两种或三种特异性抗原结合位点的抗体融合蛋白。例如，BiKEs可以同时结合肿瘤抗原以及NK细胞表面的CD16分子，这种交联作用不仅可以拉近靶细胞和NK细胞的距离，同时也能够激活NK细胞，从而进一步增强效应分子杀伤肿瘤细胞的能力。

(3)NK细胞抑制性受体或者免疫检查点的阻断：

NK细胞表面表达多种抑制性受体，通过阻断NK细胞的抑制性受体，以促进其细胞毒性。以单克隆抗体IPH2101和IPH2102(lirilumab)为例，它是一种IgG4单抗，能够阻断KIR2DL1和KIR2DL3与HLA-C类分子的结合，其疗效治疗AML的Ⅰ期临床试验中得到验证，但是单独使用lirilumab治疗MM的Ⅱ期临床试验效果不佳。因此，关于lirilumab的疗效，以及是否需要与其他单抗联合使用等问题，仍需进一步探索。

CD94/NKG2A是NK细胞表面另一个重要的抑制性受体，其配体为HLA-E类分子，在肿瘤微环境中，HLA-E类分子的高表达是靶细胞免疫逃逸的常见原因。Monalizumab单抗可以通过阻断NKG2A与HLAE分子的结合从而解除NK细胞的免疫抑制状态。

免疫检查点抑制剂是近年来免疫治疗的新方案，这些单抗主要通过阻断免疫检查点，以再次激活耗竭的T细胞或者NK细胞。以最经典的免疫检查点PD-1为例，肿瘤患者的NK细胞表面PD-1表达水平增高，利用相应的PD-1单抗能使处于耗竭状态的NK恢复杀伤活性。通常情况下，这些单抗多采用弱ADCC活性的IgG4亚型，发挥单纯的阻断剂的作用，但是阿维鲁单抗(avelumab)除外，具备传统的阻断功能的同时，还能介导ADCC作用。

(4)免疫调节药物：

目前在抗肿瘤免疫中也广泛使用免疫调节药物(immunomodulatory drugs,ImiDs)。如来那度胺(lenalidomide)可结合和激活CRBN蛋白，CRBN是一种广泛存在的E3泛素连接酶，能够诱导多种蛋白的快速泛素化和水解。其水解的底物包括对于淋巴细胞激活有重要调节作用的Ikaros和Aiolos转录因子。这两种转录因子可以抑制T细胞产生IL-2，因此最终结果是来那度胺可以诱导IL-2的分泌，从而间接增强了NK细胞的功能。此外，来那度胺还可以直接刺激NK细胞分泌IFN-γ，并降低NK细胞表面抑制性受体的表达，多方面增加NK细胞的杀伤活性。泊马度胺(pomalidomide)的作用机制与来那度胺类似。有研究显示，将免疫调节药物与单克隆抗体联合使用，不仅能够增加ADCC作用，还可以激活耗竭的NK细胞。