体外制备DC疫苗的方案

目前临床试验中使用的诱导DCs生成的方法包括：

①从单核细胞或CD34+造血前体细胞中分化成DCs；

②分离和富集循环血液中不同亚型的DCs；

③刺激外周循环的DCs在机体内的直接扩增。尽管目前的临床试验尚未直接对比不同方法生成的DCs的临床疗效，但是通过转录组测序分析不同方法制备的DCs显示，这些DCs与体内DCs亚群存在本质的不同。从单核细胞或CD34+造血前体细胞中分化成的DCs和巨噬细胞的表达谱更相似。离体产生的DCs的免疫表达谱与体内天然存在的DCs的免疫表达谱不同，这预示着它们之间功能存在差异。尽管存在差异，但临床前和临床试验均表明由单核细胞或CD34+造血前体细胞中分化而来的DCs均可诱导抗原特异T细胞的免疫应答。

(1)单核细胞诱导分化的DCs：

目前最常用的方法是从外周血单个核细胞获得单核细胞，并诱导分化生成DCs，将这一方法产生的DCs称为单核细胞诱导分化的DCs(monocyte-derived DCs,MDDCs)。具体步骤为：

①分离单核细胞：使用免疫磁珠阳性筛选外周血单个核细胞中的CD14+单核细胞或将外周血单个核细胞直接铺于黏附性培养瓶中，将黏附的细胞进行诱导；

②非成熟DCs的诱导：在培养基中加入IL-4和GM-CSF以诱导CD14-CD83-DCs的产生；

③成熟DCs的产生：使用DCs激活剂，如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、CD40配体(CD40L)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IFN-α、IFN-γ、前列腺素E2(PGE2)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、poly(I:C)等，并负载肿瘤抗原以构建抗原特异的成熟DCs。最终，将分化成熟并负载抗原的DCs分装冻存，按计划在免疫接种时复苏并回输患者体内。尽管自体DC疫苗是最佳选择，但是也有使用同种异体的MHC部分相合的DC疫苗用于临床试验。使用MHC部分相合的DCs负载肿瘤裂解物制备的疫苗治疗肾细胞癌可产生部分免疫应答。

此外，从脐带血诱导的CD11+DCs也可作为异体DCs的主要来源。脐带血诱导的DCs来源是健康人，比从患者外周血来源的DCs要健康，且可制备成现成供应的(off-the-shelf)细胞产品。HLA部分相合的异体来源的DCs靶向抗原的同时也可诱导免疫应答。

(2)CD34+前体细胞诱导分化的DCs：

使用G-CSF的预处理供者后，可从骨髓中动员CD34+前体细胞。将分离得到的CD34+前体细胞使用GM-CSF、FLT3L、TNF-α、TGF-β和SCF处理12天后会产生LCs表型的DCs细胞和大量的不同分化阶段的髓系细胞。与MDDCs相比，CD34+前体细胞诱导的LCs(iLCs)可分泌大量的IL-15，诱发更强烈的CD8+T细胞的免疫应答。一项对比了负载相同抗原的MDDCs和iLCs治疗黑色素瘤的临床试验证实，与iLCs相比，通过输注额外的IL-15,MDDCs可诱导与之相似的抗肿瘤T细胞的免疫应答(NCT00700167)。另外，将抗原肽稳定表达于iLCs中，可延长抗原特异的CD8+T细胞的免疫应答。

另外一种方法是使用MS5基质细胞与CD34+前体细胞共培养，同时加入Flt3L、SCF和GM-CSF细胞因子，可分化得到所有三种主要类型的DCs。该诱导方法清楚地呈现了从前体细胞发育至三种主要类型DCs的过程，即GMDPs分化为MDPs、MDPs分化为单核细胞和CDPs。CDPs包含3种主要类型DCs，即CD1c+DCs、CD141+DCs和pDCs。其中与血液中循环的CD1c+DCs相比，诱导的CD1c+DCs与MDDCs的表型更接近。由于这种诱导方法可以提高每种DCs的产量，其中pDC的产量可提高1.5倍，CD141+DC的产量可以提高9倍；因此可将三种类型的DCs分别进行药品生产质量管理规范(good manufacturing practices,GMP)的生产，并分别在临床上对比它们的免疫原性(immunogenicity)。另外，这种方法也适合将DCs进行基因改造，提高其抗原呈递能力。

(3)外周血DCs：

美国FDA批准的首个细胞治疗产品Provenge(Sipuleucel-T)是富含CD54+外周血细胞的疫苗，用于治疗激素型难治前列腺癌[插图]。Provenge是将患者白细胞经单采(leukapheresis collection)从外周血分离，并将DCs、B细胞、单核细胞和NK细胞与前列酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)和GMCSF的融合蛋白在37℃共培养33～44小时，并在48小时之内将混合细胞在30～60分钟回输到患者体内。患者每2周接受1次治疗，连续治疗3次，经过第1次和第2次治疗后，Provenge可诱导激活包括DCs的APCs并激活T细胞。Ⅰ期和Ⅱ期临床试验表明Provenge是安全的，并可诱导患者对融合蛋白的免疫应答。Ⅲ期临床试验表明，与安慰剂组相比，Provenge治疗组的36个月的中位总生存期增加了4.1个月，治疗组的生存率为31.7%，而安慰剂组为23%。天然蛋白也可诱导患者的免疫应答，但与融合蛋白相比，诱导的免疫应答较弱；另外，在混合细胞的体外培养及融合蛋白刺激后，CD54的表达水平增加，回输患者体内后，CD54的表达水平与APC的激活及患者的治疗效果正相关。除了诱导体液循环（抗原扩散）和细胞免疫反应，Provenge可诱导T细胞至肿瘤微环境的浸润。为了提高Provenge的疗效，Provenge与抗CTLA-4的联合治疗(NCT01832870、NCT01804465)以及与IL-7细胞因子的联合治疗(NCT01881867)等几项联合治疗的临床试验已经完成，相关结果尚未发布。

FLT3L可诱导体内循环DCs的扩增。使用FLT3L人重组蛋白CDX-301静脉注射10天[25μg/(kg·d)]，可使外周血中CD1c+DCs数量增加130倍，CD141+DCs数量增加48倍，pDCs数量增加6到16倍，CD34+细胞增加23倍。一项临床原位疫苗(in situ vaccine,ISV)治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的试验正在进行(NCT01976585)，使用静脉输注FLT3L诱导DCs浸润到肿瘤中，再使用局部放疗的方法诱导DCs负载肿瘤相关抗原(tumor associated antigens,TAAs)，使用TLR3激动剂(poly-I:C)激活DCs，该研究初步表明，ISV可诱导至少30%患者的免疫应答（J Brody，结果未发表）。肿瘤内部分FLT3L不仅可以动员DCs进入肿瘤微环境，还可全身性的动员DCs；因此随着DCs数量的增加及激活，FLT3L可增强抗肿瘤T细胞的激活。然而，在这一过程中，不同亚型的DCs获得和呈递肿瘤来源抗原的能力尚未确定。目前，FLT3L作为单一药物用来治疗急性髓细胞性白血病(AML,NCT00006223)和结肠癌(NCT00003431)的临床试验已经完成；FLT3L与HLA-A2限制性TAA联合用于黑色素瘤或肾细胞癌患者(NCT00019396)的临床试验也已完成，但相关结果尚未发布。

(4)pDCs和CD1c+DCs：

由于细胞数量较少，在激活免疫反应中，尚无临床试验对比外周血中CD1c+DCs和pDCs的区别。一项临床研究评估了负载有TAAs的自体pDCs对黑色素瘤患者免疫反应的激活作用。使用CliniMACS分离系统获得外周血pDCs，得到的细胞平均纯度为75%，产量为(1.3～3.3)×107个。然后在IL-3的存在下培养分离的pDC，并负载HLA-A2限制性gp100和酪氨酸酶肽。尽管细胞数量较少，但自体pDCs负载TAAs并回输到患者体内是安全的，并能有效诱导患者CD4+T细胞和CD8+T细胞的免疫应答。这一研究第一次证实分离一种亚型的DCs并用于免疫治疗是可行的。另外一项临床研究使用负载有TAAs的自体CD1+DCs用于治疗转移性黑色素瘤。该研究也应用CliniMACS分离系统用于获得CD1+DCs，细胞的平均纯度为93%，数量为(2.7～9.6)×10^7。将分离得到的细胞在GM-CSF存在下培养，并负载HLA-A2限制性gp100和酪氨酸酶肽。患者每两周接受(3～10)×10^6DCs的治疗。该项研究证明了自体CD1+DCs治疗的可行性和安全性，并使少部分患者获得了CD8+T细胞特异性免疫应答。然而与pDCs和CD141+DCs相比，CD1+DCs是否可诱导足够强的抗肿瘤免疫应答还需进一步探索。

尽管大多数临床研究都将DC疫苗诱导的免疫应答作为其成功与否的衡量标准，但是大多数T细胞反应是在长期体外刺激培养后进行评估的，而在体外实验中，只有CD4+T细胞产生较弱的免疫应答。负载的抗原（患者可能已经对之产生了耐受的肿瘤抗原）、DCs的质量和数量以及缺乏向淋巴结有效迁移的能力均可能造成有限免疫应答。在接受DC疫苗的健康受试者中，当抗原是新抗原时，例如钥孔虫戚血兰素(keyhole limpet hemocyanin,KLH)或病原体衍生的抗原，均可诱导强有力的免疫应答。使用PAP-GM-CSF融合蛋白作为负载抗原的Provenge,DCs可引发CD8+T细胞对新的肿瘤抗原的应答，这表明抗原的选择决定了DCs是否可有效引发T细胞的免疫应答。