间充质干细胞的体外培养

MSC最早是通过将骨髓来源的细胞在含有血清的培养条件下培养筛选获得的异质性细胞群体。目前，大多数MSC培养采用在DMEM或α-MEM等基础培养液中添加10%～20%胎牛血清的条件下培养，在这种条件下MSC贴壁生长，呈现出类似成纤维细胞样的长梭形。胎牛血清为MSC的生长提供必需的营养因子，促进细胞贴壁生长。体外培养的MSC可以传代培养8～15代左右，这期间MSC倍增40～50次。随着传代次数的增加，MSC逐渐衰老，细胞增殖和克隆形成能力减弱，分化能力降低。MSC培养所使用血清的质量直接影响MSC的自我更新能力以及培养后细胞的分化潜能，添加胎牛血清还增加了感染外来病原体的危险，同时培养获得的MSC细胞中存在胎牛血清来源的抗原分子的问题。已有研究发现将MSC输注到人体后会引起机体产生抗牛血清蛋白的免疫反应。这些问题不利于MSC进一步的临床应用，优化MSC的培养体系、寻找替代血清的关键因子甚至成分明确的培养体系就显得意义重大。

研究表明bFGF、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)等细胞因子参与对MSC的生长和分化的调控，其中bFGF在促进MSC细胞增殖、保持细胞的多能性方面具有重要的作用。在一些成分明确的MSC培养液中，bFGF结合PDGF和胰岛素可以代替血清的作用。血小板包含多种细胞生长因子，包括PDGF、TGF-β1、bFGF、IGF-1等。2005年，Doucet等报道血小板裂解物可以代替血清用于MSC的培养，添加血小板裂解物培养的MSC具有更好的克隆形成率，细胞增殖更快，同时保持了MSC的分化和免疫抑制能力。血小板裂解物相对血清更安全，比较适合建立大规模临床级MSC细胞培养体系。不过，对于添加血小板裂解物培养的MSC细胞与常规添加血清培养条件下获得的MSC在免疫调节能力、分化潜能是否完全相同还有待更多的研究。

除了细胞培养液，MSC还受到其他一些因素的影响，例如环境压力、氧浓度、细胞培养瓶的材质等。骨髓来源的MSC在骨髓中处于相对低氧（4%～7%氧气）的条件，而大部分体外细胞培养条件采用20%氧浓度条件。在低氧条件下，MSC通过缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α感知氧浓度的变化，调控与细胞增殖、存活、糖酵解以及血管生成相关基因的表达。多项研究表明低氧条件下培养的MSC增殖更快，干性相关基因的表达水平升高，而且低氧条件处理的MSC能更好地维持细胞成骨分化、促进血管生成的能力。在细胞培养方法上，除了常规的单层细胞培养，还可以采用微载体结合生物反应器等方法对MSC进行大规模的培养扩增。常用的微载体尺寸大约90～380μm，芯材可以采用改性聚苯乙烯，纤维素，右旋糖酐，明胶等，同时微载体表面可以结合胶原蛋白，纤连蛋白，二乙氨基乙基，三乙铵等以促进MSC的黏附生长。