TCR-T细胞

将抗原特异性TCR导入T细胞生产的抗原特异性T细胞称为TCR修饰的T细胞(TCR engineered T cells,TCR-T)。TCR修饰的T细胞已在转移性黑色素瘤、结直肠癌、滑膜肉瘤和MM的患者中显示出临床疗效。

（一）合适的抗原选择

在癌症进展的过程中，恶性肿瘤细胞可以表达与正常细胞不同的蛋白。而这些蛋白就是用于制备TCR-T的候选抗原。抗原可以是肿瘤细胞特有的，也可能是在肿瘤细胞和正常细胞中都表达的共有抗原。共有抗原包括肿瘤分化抗原，肿瘤特异性抗原及在肿瘤细胞中过表达的抗原。肿瘤分化抗原和过表达抗原可以诱导T细胞的应答，例如MART-1、gp100、CEA和p53等。肿瘤特异抗原可以诱导免疫应答，是用于制备疫苗和T细胞过继免疫治疗的候选抗原，例如MAGE-A3、MAGE-A4和NY-ESO-1。独特的抗原是仅由肿瘤细胞表达的异常蛋白质。在某些癌症中发现的病毒相关抗原可用于产生抗原特异性T细胞，例如人乳头瘤病毒。

近年来，发现可用于精准免疫治疗的新抗原备受关注。新抗原是指在正常组织中不表达，仅在肿瘤组织表达的抗原，包括致瘤病毒整合进基因组产生的抗原和蛋白突变产生的抗原，新抗原不仅具有较高的特异性，而且因其未经胸腺阴性筛选而具有较强的免疫原性。通过全基因组或全外显子组测序可鉴定个体化免疫治疗的最佳新抗原。通过表达谱测序可鉴定HLA的表达并预测HLA是否会将新抗原呈递至胞外以被T细胞识别。使用供者T细胞可诱导识别突变蛋白的T细胞，并对转移性肿瘤细胞具有有效的杀伤作用。CD4+T细胞和CD8+T细胞可靶向来自肿瘤细胞的表观遗传、转录、翻译和翻译后改变的抗原。近期研究表明，许多肿瘤细胞特有的内源性突变蛋白可以被加工成多肽并呈递到肿瘤细胞的表面，从而可以被免疫系统识别为外来抗原，并被自身免疫系统清除。因此，新抗原是免疫治疗的理想靶点。可以作为制备TCR-T候选靶点需要具备以下特征：

①肿瘤特异性：在肿瘤组织中特异表达，而在正常组织中不表达；

②与肿瘤的发生发展相关；

③可以引起T细胞应答。选择合适的抗原是决定T细胞有效性的第一步，也是最重要的一步。

（二）获得特异TCR序列的方法

目前有3个获得TCR序列的方法，传统的方法是将可以识别携带有突变表位的四聚体(tetramers)的自体外周T细胞分选出来，使用极限稀释或流式分选的方法将单个T细胞铺于96孔板中，使用饲养层细胞和细胞因子进行单细胞扩增培养，将扩增起来的T细胞使用5'RACE的方法进行TCR序列的鉴定。利用这种方法，已鉴定出多种抗原特异性T细胞，它们能有效地识别肿瘤相关抗原。使用这种方法获得的肿瘤特异性TCRs制备的TCR-T的功能已在临床试验中进行了验证。例如靶向NY-ESO-1特异性TCR-T细胞的临床疗效已在滑膜细胞肉瘤、黑色素瘤和MM得到证实。

图  　获得TCR序列的方案

近年来，多种快速鉴定TCR序列的方法被研发出来，比如单细胞RNA-seq和配对SEQ(pairSEQ)。单细胞RNA-seq可以同时处理数千个细胞的转录组，可以鉴定每个T细胞的独特TCR以及成对的α和β异二聚。PairSEQ技术利用TCR序列的多样性来准确识别上千对TCR α链和β链，因此可用于识别TILs的TCR序列。TCR序列的信息可以用来制备表达抗原特异性TCR的T细胞。这些新技术有极大的潜力推动TCR-T细胞治疗的发展。

（三）TCR-T临床前试验研究

通过TCR-T细胞靶向肿瘤细胞与正常组织共有的分化抗原，例如MART-1、gp100和CEA，可能对正常细胞产生毒性并损害关键器官。因此，需要评估TCRT的脱靶效应。尽管某些抗原未在正常组织中广泛表达，仅在肿瘤组织、胎儿组织和成年睾丸上表达，但未在其他正常成年组织上表达的NY-ESO-1和MAGE家族，但这些TCR-T的安全性和亲和力仍需进行评估。另外，可能由于TCR-T细胞中逆转录病毒导入的基因表达被下调，输注患者体内的TCR-T细胞没有疗效。通过慢病毒携带双启动子表达TCR的载体导入T可能是TCR-T免疫治疗的有效工具。

（四）TCR-T的临床应用

使用TCR-T细胞的过继免疫疗法已成为癌症治疗的重要策略，近期的临床试验已得到令人鼓舞的结果。2006年的一项临床试验首次报道了MART-1 TCR-T可以介导黑色素瘤消退，随后2009年和2014年也进一步报道了类似的结果。一项靶向gp100的TCR-T的临床试验显示，19%接受治疗的患者产生了客观的抗肿瘤反应。使用靶向HLA-A*0201限制性NY-ESO-1抗原的TCR-T的临床试验表明，超过50%的滑膜细胞肉瘤、黑色素瘤和骨髓瘤患者出现客观应答。使用靶向HLA-A*2402限制性MAGE-A4抗原的TCR-T细胞治疗食管癌患者后，可长期在体内生存，其中三名患者维持小肿瘤病变超过27个月。以上临床试验表明，TCR-T细胞治疗可以显著降低肿瘤负荷。尽管使用TCR-T细胞进行过继细胞治疗后取得了很大进展，但其引发的毒副作用仍需引起关注。在一项针对转移性结直肠癌的临床试验中，使用高亲和力CEA TCR-T进行治疗，三位患者均因TCR-T对表达CEA的正常结肠上皮细胞反应而发展为严重的短暂性结肠炎。在另一项研究中，为了增强识别HLA-A*01限制性MAGE-A3 TCR的亲和力，突变了MAGE-A3 TCR α链CDR2区的4个氨基酸，尽管这增强了TCR识别MAGE-A3的能力，但两名患者在输注经TCR改造的抗HLA-A*01限制性MAGE-A3的T细胞后死于心源性休克。这可能由于亲和力增强的TCR识别了正常心脏组织中其他蛋白，也可能由于没有通过自然胸腺选择的过程，增加了心脏的毒性。另一项自体MAGE-A3 TCR-T细胞临床试验导致两名患者陷入昏迷，最后死亡。随后发现该MAGE-A3 TCR-T细胞识别了大脑中MAGE-A12的衍生表位。因此，由于潜在交叉反应的存在，需仔细评估TCRs的亲和力，并选择合适的抗原以保证临床应用的安全性。

（五）改造肿瘤微环境以提高TCR-T疗效

提高TCR-T细胞的功能，可克服肿瘤微环境中的免疫抑制因子并提高消除肿瘤的能力。增加TCR信号强度并提高T细胞的功能可增强抗原反应性和规避T细胞耐受性。正如前文所述，免疫检查点蛋白，例如PD-1和CTLA-4，可以阻止免疫系统中T细胞的活化。目前已证实阻断PD-1信号通路可改善TIL的功能并增强其抗肿瘤能力，因此，PD-1/PDL1信号通路可能是抗原反应性的主要负反馈调节剂。TCR-T细胞由于表达高水平抑制性受体PD-1，使其功能降低。将NY-ESO-1 TCR-T细胞与PD-1抑制剂联合使用，可增强其肿瘤抑制作用。此外，肿瘤细胞还可通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成、诱导外周免疫耐受等方式影响局部微环境。相反，微环境中的免疫细胞可以影响癌细胞的生长和进化。重组细胞因子通常用于治疗癌症，尤其是IL-2。IL-2可以刺激抗原特异性T细胞的增殖，分化和存活，并已单一被用于包括黑色素瘤在内的几种不同癌症类型。

与上述免疫检查点蛋白和免疫抑制细胞因子不同，抗原特异性T细胞的数量可以受到肿瘤微环境趋化因子的影响。趋化因子CXCL10维持效应T细胞亚群。由CD8+DCs产生的趋化因子CCL17可招募表达趋化因子受体CCR4的幼稚细胞毒性T细胞。

使用TCR-T细胞联合趋化因子、细胞因子和免疫检查点蛋白的药物治疗可抑制肿瘤细胞免疫抑制作用而表现出更强的疗效，可能在未来的治疗中获得更好的临床反应。

（六）总结

使用TCR-T细胞的过继细胞疗法已经取得了相当大的进展，但仍需进行以下探索：

①克服肿瘤微环境中存在的免疫抑制因子；

②延长TCR-T细胞在体内肿瘤部位的寿命；

③制备针对不同抗原表位的不同类型的TCR-T细胞。

虽然一些抗体或重组细胞因子可以与TCR-T细胞联合应用，但肿瘤微环境中仍存在一些目前尚不明确的可影响预后的因素。我们知道，初始T细胞一旦被激活，在TCR-pMHC相互作用后迅速增殖并分化为效应T细胞和记忆T细胞。虽然分化的效应T细胞可以产生多种效应分子，但这些细胞高表达耗竭相关蛋白并快速死亡。通过抑制T细胞的耗竭可延长有效的免疫反应。改变代谢途径以增强TCR-T细胞的持久性。已经显示，mTOR信号、AMPK-α1信号和IL-7信号支持记忆CD8+T细胞的发育。因此，可通过表达代谢相关分子延长TCR-T的存活时间。

一项临床试验观察了2名Ⅳ期黑色素瘤患者新抗原的动态变化，发现T细胞识别的新抗原在肿瘤部位表达减少甚至丢失。因此，向患者输注识别不同新抗原的TCR-Ts，可提高其临床反应。