精子冻存与复苏

精子冷冻是在一定低温条件下使精子细胞代谢降低至休眠状态，保存精子活力和功能的有效方法，以达到储存精子的目的。

人类精液的冻存在男性生育力保存方面发挥着重要作用，技术已相对成熟，并广泛应用于辅助生殖临床和生殖生物学研究中。主要应用：

①供精人工授精：精液冻存是供精人工授精的基础，将供者的精液冻存，在受者需要时解冻；

②生殖保险：患者在进行可能损伤生育力的治疗前（如肿瘤患者进行放疗、化疗）进行精液冻存，在需要生育时进行精液解冻；

③自精保存：因各种因素在取卵日无法到场或取精困难、极少精子患者，提前进行冷冻，可避免取卵当天取精失败无精可用的窘境。

一、精子冻存的冷冻保护剂

即使在不使用冷冻保护剂的情况下，人类精子也能够耐受一定程度的低温冻存，这是源于精子自身体积较小、细胞内水分含量较少，低温下产生的冰晶较少，特殊生理结构使其对冷休克的损伤不敏感。精子细胞内含有大量的蛋白、糖等黏性物质，成为天然的冷冻保护剂，可减弱冷冻过程中冰晶对细胞的损伤；另外，精子膜中磷脂、糖脂、固醇含量较高，更能耐受低温。但低温冷冻必然对精子造成一些损伤，包括由于细胞内冰晶形成所致的物理性损伤和高溶质引起的溶液效应所造成的化学性损伤，引起细胞膜、细胞质和细胞器化学结构不同程度的改变和能量代谢紊乱，引起精子结构及功能受损。研究显示，人类精液未经处理而行冷冻复苏后，只剩下千分之一的精子还具有某种程度的活力，因此在精子进行冻存时需要加入冷冻保护剂，以提高精子的复苏率和受精能力。

根据对细胞膜是否具有渗透性，冷冻保护剂分为渗透性物质和非渗透性物质，渗透性物质包括甘油、乙二醇、二甲亚砜等；非渗透性物质包括氨基己酸、蔗糖、乳糖等。

甘油是最早被发现对精子的低温保存具有保护作用的物质，也是目前最为常用的精子冷冻保护剂。甘油是一种渗透性冷冻保护剂，分子量大，能插入精子膜的双层分子中，诱导膜结构变化，同时通过OH基团与水形成氢键，与水分子互溶后渗入细胞内，修饰细胞膜，改变细胞膜的稳定性和水的通透性，降低细胞内液体冰点，减少细胞内冰晶形成，具有稳定细胞内电解质浓度与膜内保护剂的作用。但甘油也可干扰ATP合成与利用间的平衡，改变精子的生物能量状态，对精子造成损伤。甘油加入的量对精子冻存效果存在影响，终浓度以7.5%为宜，高于10%时影响精子活力，低于5%时冷冻保护效果较差；另外，甘油需逐滴加入，每加一滴后轻摇使其与精液混匀，滴加速度不能过快，否则将引起精子内渗透压改变、精子膜皱褶而导致精子死亡。

目前应用最为广泛和成熟的精子冷冻保护剂多以甘油为基础，根据是否加入甘油及其他成分分为三类：单一甘油型、甘油复合型和无甘油型。甘油复合型添加蛋黄、白蛋白或蔗糖等高分子物质及两性离子缓冲系统。白蛋白可以降低细胞氧耗量，减少氧自由基的产生，减轻冷冻引起的精子冷休克；葡萄糖和蔗糖是小分子非渗透性冷冻保护剂，通过增加跨膜的渗透压梯度而产生高渗环境脱去精子内部水分并稳定细胞膜，从而达到冷冻保护作用；卵黄所含低密度脂蛋白可附着于精子细胞表面，调节降温复温过程中细胞内外的电解质平衡，卵黄所含卵磷脂可稳定精子细胞膜，防止顶体破裂，并能取代精子膜上受损或丢失的磷脂。因卵黄来源于鸡蛋，有传播疾病和致敏的可能，有报道从大豆卵磷脂中提取的磷脂具有蛋黄类似的效果，有望成为精子冷冻保护剂中蛋黄的替代物。

此外，扩容剂和抗氧化剂等也有利于提高精子冻融后的复苏率。扩容剂的作用为优化渗透压与pH；提供能量来源，防止精子细胞内磷脂的使用。主要包括两性离子、果糖、柠檬酸盐、卵黄柠檬酸盐、TEST柠檬酸盐卵黄缓冲液、人类精子保存基质等。精液在冷冻-复苏过程中，抗氧化体系受到影响，精子膜损伤后对活性氧水平的变化尤为敏感，在精子冷冻保护剂中添加抗氧化剂，可以有效清除冻融过程中产生的过多的氧自由基，避免精子的过氧化损伤。如在TEST-柠檬酸盐卵黄缓冲液中添加二硫苏糖醇，可防止巯基氧化，此方法对精子质量较低的精液和白细胞精子症患者的精液冷冻更为有益。

目前常用的精子冷冻保护剂有：

①7.5%单一甘油；

②含15%甘油的Tyrodes改良液（HSPM）；

③Earle-血清-甘油：含人血清白蛋白10%、甘油15%；

④甘油-蛋黄-枸橼酸钠（GYC）：葡萄糖 2.0g、枸橼酸钠 1.5g、甘油 15ml、鸡蛋黄 15ml及8IU 庆大霉素 0.3ml，加蒸馏水至100ml，NaOH调节pH至7.2；

⑤改良GYC：葡萄糖2.0g、蔗糖0.01mol、柠檬酸钠3.4g、甘氨酸1.0g、甘油15ml及蛋黄15ml，加蒸馏水至100ml，NaOH调节pH至7.2；⑥TESTRIS缓冲系统-蛋黄-柠檬酸-甘油 （TYG）。

二、精子冻存与复苏方法

（一）速冻法

速冻法又称液相冷冻法，冷冻前不做冷平衡，将精液与冷冻保护剂混合后从常温直接浸入液氮。速冻法迅速跨过细胞内冰晶形成的危险温度区（-80～-5）℃，减少冰晶对细胞的直接损伤。然而在实际操作中，由于冷冻载体多采用冻存管，冻存管体积较大，热传导较慢，降温速率远未达到理想的玻璃化态，难以实现真正的速冻。

（二）缓冻法

缓冻法可通过程序冷冻仪实现缓慢降温、冷平衡，减少冷休克对精子的损伤。程序冷冻仪自动化程度高，能够精确地控制降温速率，在临床上已广泛应用于精液冷冻。由于各生殖中心和精子库使用的冷冻保护剂和冷冻载体存在差异，目前对于降温程序尚无统一标准。

文献中降温程序示例：

例一：从室温 ～-5℃，每分钟降温 1℃；（-60～-5）℃，每分钟降温 30℃；（-150～-60）℃，每分钟降温10℃；投入液氮保存。

例二：从室温～-6℃，每分钟降温1.5℃；（-100～-6）℃，每分钟降温6℃；-100℃保持30分钟；投入液氮保存。

（三）改良缓冻法

改良缓冻法又称气相冷冻法，方法为室温或4℃冰箱放置10分钟，液氮面上方5～10cm蒸气层内放置10～15分钟进行冷平衡，然后投入液氮。各实验室在有无室温、冰箱放置步骤、液氮蒸气层内放置时间上存在差异。改良缓冻法的优点为操作简单快捷，不需要昂贵的仪器，缺点为受人为及环境因素的影响较多，测量液氮液面高度时标准也不易统一，在液氮蒸气层中放置时，随液氮蒸发液面高度发生变化，因此对降温的控制存在偏差。

（四）玻璃化冷冻法

2002年Nawroth首次报道使用无保护剂的玻璃化冷冻精子。只要载体体积足够小达到极高的冻融速率，就可以在不添加冷冻保护剂的情况下实现溶质的玻璃化，因无细胞内外的冰晶形成减少了细胞的损伤。玻璃化冷冻具有诸多优势：冷冻过程快速省时，无需昂贵的仪器，避免了冷冻保护剂的化学毒性，冷冻损伤小。玻璃化法由于其载体微小，常被用于微量精子的冷冻，可提高此类精子的回收率和复苏率。

（五）精子复苏方法

冷冻精子复苏方法的选择与冷冻方法有关，需要根据不同的冷冻方法选用，原则是快冻快复、慢冻慢复。速冻法的快速降温使精子细胞内产生小冰晶，需快速复温，迅速越过冰晶形成的敏感温度带。缓冻法的慢速降温使精子细胞外的水分首先结晶，胞外溶质浓度的升高导致精子细胞脱水，若复温太快精子外溶化的水分来不及回渗，则会造成精子皱缩、溶质过多，产生化学损伤。

以快冻快复为例，解冻方法为：准备37℃水浴锅，从液氮中取出精子冷冻管，直接投入水浴锅中，轻柔旋转冷冻管，5～10分钟后精液充分融解后取出。也有在室温空气中停留2～3分钟，再迅速放入37℃水浴中解冻。慢冻慢复则在室温下复温。

三、冷冻载体

人类精子的冷冻载体经历了多种方式：安瓿瓶（小玻璃管）因容易爆裂，已逐渐弃用；螺口塑料冻存管（管身用聚丙烯材料，管帽用聚丙烯或聚乙烯材料）；塑料麦管（聚氯乙烯PVC或聚对苯二甲酸乙二醇酯-1，4-环己烷二甲醇酯 PETG）；高安全性麦管（离子键树脂）。

冻存管是国内使用最多的精液冻存载体。方法是将精液与冷冻保护剂的混合液分装入冻存管。冻存管容量大，使用方便，易于大规模操作，存储运输方便。缺点是在降温与复温过程中，外层与中心层温度不均匀，降温和复温速率各区不一致，对精子的损伤较大，且有爆炸和破裂的风险，易造成精液的丢失及对操作人员有危险。

麦管在欧洲国家中使用较多，方法为特制的麦管一端封闭，用无菌针筒将精液与冷冻保护剂的混合液注入麦管中，全部混合液分装入若干麦管。此方法的优点是麦管空间小表面积大，降温均匀，复温时受热快且均匀，对精子损伤较小；缺点是麦管容量小，对于量多的精子需要大量麦管分装，操作繁复。

极少量的精子可采用透明带法保存。透明带来源于IVF实验室废弃的卵及胚胎或鼠胚，采用显微注射针将卵胞质或胚胎内的细胞球吸出，只剩空透明带。按照显微注射常规操作流程吸取精子，将其注入空透明带中，每个透明带内最多存放5个精子。将存有精子的透明带放入精子冷冻保护剂中，再装入胚胎冷冻用麦管，两边以空气柱隔开，以确认透明带位置，用精子冷冻程序进行冷冻。复苏后，按照显微注射常规操作流程将透明带内精子精子吸出待用。透明带来源对精子冷冻后复苏率无差异，但是精子和人源透明带发生顶体反应会导致复温后精子丢失和受精率降低，也存在生物安全性和伦理的问题。

四、精子复苏后的质量评估

目前评价精子冷冻效果最主要的指标是复苏率，但解冻后精子的内在功能，如精子形态、顶体及膜功能对精子是否具有受精能力也有十分重要的作用。因此，精子冷冻的目标在于提高精子存活率的同时提高精子质量。

（一）精子的功能评估

复苏率是评估精子冷冻后复苏效果的基本指标，表现为精子的运动能力。按《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作实验室检验手册》第5版对精子的浓度、前向运动精子数目、活动精子数目进行观察和计算，得到精子解冻后的活力和活率，与冷冻前精子情况进行对比得到复苏率。精子膜的完整性与精子获能、精卵结合密切相关，测定精子膜功能可以准确反映精子功能并预测精子的受精能力。顶体酶在精卵结合的过程中起溶解透明带的作用，是受精过程中最为关键的酶，其活性高低可直接影响受精结果，因此顶体酶活性是反映精子质量的重要指标。在冷冻精子复苏后对其进行检测，可评价精子的受精能力，是精子功能评估的一项重要指标。受精和受孕能力是精子冷冻后复苏效果最主要的评价指标。精子解冻后行人工授精或体外受精，可统计受精、胚胎发育和临床分娩结局。

（二）精子的形态和结构评估

精液中形态正常精子的比例与受孕直接相关，精子畸形率是精子的主要参数，包括头部、颈部、尾部畸形。按《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作实验室检验手册》第5版对解冻后精子形态进行观察，记录畸形精子指数（缺陷总数/缺陷精子数）和精子畸形指数（缺陷总数/所数精子总数）。顶体是精子头部的重要组成部分，许多研究表明精子顶体完整率是精子是否具有受精能力的主要预测参数，冷冻复苏过程可能会造成顶体损伤。因此，精子顶体完整率应作为精子复苏效果的评估指标之一。

冻融过程中温度的巨大变化、细胞内外冰晶形成和渗透压变化，可引起精子细胞膜、线粒体膜的损伤及精子DNA完整性的缺失。通过电镜可对精子超微结构进行观察。正常精子细胞膜完整，顶体内膜和外膜结构清晰，核膜完整，顶体内膜与核膜呈平行排列。精子冻融后的生物膜及亚细胞结构基本完整，冷冻损伤的改变主要位于头部，可见核内空泡，不仅体积增大且空泡数量增加。核膜异常包括核后间隙增大、后核膜增生，有时可见核膜部分或全部缺失。顶体内膜和外膜分离，内膜与质膜相贴，严重的损伤将导致顶体肿胀、破损，顶体膜脱落，顶体内容物丢失。膜完整性可通过低渗肿胀实验、凝集素实验等检测。DNA完整性的检测技术较多，包括吖啶橙染色、末端转移酶介导dUTP末端标记法、彗星实验等。

五、影响精子冻存效果的因素

影响精子冻存的因素众多。相关性分析显示精子浓度和活力与冷冻复苏率呈正相关，浓度高、活力好的精子在冻融后可获得较好的复苏率。对于少弱精者，可通过密度梯度离心法或上游法对精子进行浓集，通过提高精子浓度改善精子冻存效果。形态异常的精子，特别是头部畸形及同时具有多种畸形的精子对冷冻的耐受性较差。表现在精液参数中，可见畸形率高的精液冻融后复苏率较低，前向运动精子率减少。取精后至冷冻前的间隔时间也影响冻存效果。有研究显示，精液取出后最好在30分钟内进行冷冻操作。精液精子长时间孵育会导致精液中活性氧过量生成，可破坏精子DNA及精子膜的流动性和完整性。

生物体的代谢活动随温度降低而下降，在一定的低温下近乎完全抑制而达到长期保存的效果。这些代谢活动主要由酶的催化来实现，根据细胞生物学理论，细胞的某些酶在零下几十摄氏度时依然有一定的活性，可使细胞维持缓慢、简单的代谢活动。Arrhenius曾根据随温度降低而衰减的化学反应速率，推算出低温状态下生命体的保存时间，以生物体在4℃能存活2小时为基础计算，在-40℃可保存数日，在-80℃可保存数月，在-196℃则可以保存几百年。目前，对于冷冻精液保存时间最久的报道是两例通过液氮冻存的精液，在冷冻28年后解冻，通过人工授精获得了成功妊娠。临床上所出现的精子复苏率随存储时间延长有所下降的情况，可能与储存过程中精子冷冻管多次随其他需要解冻的精子从液氮中取出暴露于室温有关，为保证冷冻质量，冷冻精子应做到独立存储标本。

六、精子冻存的应用

精子冷冻技术的临床应用广泛。规范标准操作、改进冷冻方法、开发新型冷冻载体、关注精子复苏质量等，仍是人类精子冷冻技术面临的主要问题。

目前尚无直接的证据表明冷冻保存的过程存在交叉污染，但不能因此忽视交叉污染存在的风险，应谨慎对待精子的冷冻储存及使用，采取一定的预防手段将交叉污染的风险降至最低水平。精子冷冻涉及多学科的交叉研究，随着技术发展和方法改进，人类的精子冷冻保存定会长足进步，更好地应用于辅助生殖领域。