HLA的分型技术

（一）血清学方法

 在PCR技术发明之前，HLAⅠ类抗原是由补体依赖的微量细胞毒试验和一些含有HLA抗体的抗血清检测。这些抗血清都具有HLA特异性，通常从经产妇的外周血提取获得。使用血清学方法检出的HLA抗原存在交叉反应现象。比如一位个体受到HLA-A2抗原的免疫刺激后产生HLA抗体，该抗体不仅能与A2抗原反应，还能与A28、A68等抗原反应。交叉反应抗原可分为交叉反应组。早期推测同属于一个交叉反应组的抗原具有共同的抗原决定簇。近年对HLA的DNA序列分析发现，交叉反应抗原具有非常类似的氨基酸序列。由于交叉反应抗原之间的免疫原性较接近，因此早期的非血缘移植，当没有找到HLA全合的供者时，具有交叉反应抗原的供者将被优先选择。 

（二）细胞学方法

 体外混合淋巴细胞培养技术（mix lymphocyte culture，MLC）用于检测供受者间HLA-D抗原的相容性。如果供受者间HLA-D抗原不相容，则MLC方法中淋巴细胞将被活化并产生增殖，增殖程度与个体的HLA-D抗原的不相容程度成正比。MLC有两种方法，一种是双向MLC，两个个体的淋巴细胞不作任何处理，直接混合培养，这时双方相互识别，均被激活；另一种是单向MLC，一个细胞不作处理，另一个细胞用丝裂霉素C或照射处理，使其不能活化增殖，但具有刺激能力。在HLA-D分型中，将已知型的纯合子分型细胞，经过处理使其失去应答能力后，和不作处理的受检细胞混合培养，如受检细胞无应答说明它具有和已知型的纯合子细胞相同的D抗原。由于MLC并不能预测临床上重度急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发生风险，因此在20世纪80年代后期，随着分子分型技术的发展，DNA分型技术逐渐取代了MLC技术在Ⅱ类分子分型中的应用。 

（三）DNA分型技术

 进入20世纪80年代后期，PCR技术的发明将HLA的分型技术带入了DNA分型研究阶段。Bidwell等利用限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）对HLAⅡ类抗原在DNA水平进行分型，随后利用该项技术发现了Ⅱ类区域许多以往未检测出的多态性。众多的DNA分型技术相继被发明，目前有三种主要的技术应用于临床及科研：序列特异性引物（sequence-specific primer，SSP）方法、序列特异性寡核苷酸探针（sequence-specific oligonucleotide probe，SSOP）杂交和DNA序列测定（sequence-based typing，SBT）。SSP技术是一种简单、低成本的用于HLA低、中分辨分型的方法；SSOP和SBT方法是一种HLA高分辨、大通量的分型方法。随着这些技术在研究及临床应用的增多，促使了新HLA等位基因的发现。 

（四）第二代测序技术

 第二代测序技术通过捕捉新合成的末端标记来确定DNA的序列，即边合成边测序。第二代测序技术是一种高通量测序技术，具有检测速度快、准确率高、实验周期短等优点。另外第二代测序可以直接获得唯一的等位基因分型结果，解决了SBT分型中模棱两可的分型结果，也有利于新HLA等位基因的发现。虽然目前第二代测序技术并不是主流的HLA分型技术，但是随着技术的进一步发展及成本的降低，其临床应用也会更加普遍。